Fundamentos De La PCR Cuantotativa En Tiempo Real Flashcards
(18 cards)
PCR características
Amplificacion
* Reacción en cadena de polimerasa (PCR)
* Kary Mullis (1983)
* Técnica de replicación in vitro de una molécula de ADNg.
* La longitud del fragmento que se quiere replicar estará delimitado por los primers o cebadores u oligonucléotidos
Principios basicos de PCR
- Complementaridad
- Dirección 5’-> 3’ (requiere que el extremo 3’ esté libre)
- Consta de 3 etapas:
- Desnaturalizacien
- Replicación
- Elongacion
dNTPs
Desoxinucleótidos libres en forma tritostatada estabilidad), estos fosfatos ayudarán a formar el enlace fosfordiester (nucléotido-nucleótido)
concentracion 50-200mM
Que tiene una PCR
Taqpolimerasa
dNTPs
Mg
buffer
Primmer
DNA
Agua
Tipos de PCR
Convensional
Cualitativo
Semicualitativo
Cuantitativo
Multiple
PCR convencional
- Amplificación de región genetica especifica
- Se evalua por medio del gel de agarrosa o acrilamida
PCR cualitativo
- Permite identificar presencia o ausencia de un fragmento especifico
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas
PCR semicuantitativo
- Permite conocer los niveveles de expresion de gen (ARNm) (biopsias)
PCR cuantitativo
- Permite medir la cantidad de microorganismos o en ARNm de un gen particular
- Como referencia una curva con muestras con concentraciones conocidas
PCR multiple
- Amplifícación de varias regiones géneticas en una misma reaccion de PCR
- Cada región cuanta con pares de oligos
Proceso de PCR
- Inicio de la desnaturalización (95°; 5 min)
- Ciclos de amplificacion (35-40ciclos)
* Temperatura de desnaturalización (95°; 30s)
* Temperatura de alineamiento (50-60°C; 30-40s)
* Temperatura de extension (72°C; 30s) - Amplificación final (72°C)
4- almacenamiento tempora (4°C)
PCR en tiempo real
- Higuchi et al (1992), describieron una modificación de la técnica de PCR tiempo final.
- Adaptando la técnica a un análisis simultáneo de varias secuencias -> PCR tiempo real o PCR cuantitativa
- En tiempo real se va observando el crecimiento de la curva de amplificación
Pasos de PCR en tiempo real
- Amplicación
- Desnaturalización
- Alineamiento
- Extension
- Detección -> mediante fluorescencia
Menos específica, se pega a todo el DNA de doble cadena: PCR CUANTITATIVO: EJ. carga viral, si incrementa o disminuye
SYBER green
SNPs, y tiene zonda (R y Q) GENOTIFICAR
TaqMan
Detección características
- Las sondas tienen 2 flouroforos o reporteros VIC y FAM
- Muy cercano se encuentra el apagador (absorbe la fluoresencia del reportero)
- El analisis permite identificar la fluoresencia conforme avanza la reaccion
Ventajas de PCR en tiempo real
- Es posible calcular la eficiencia de la reacción
- No es necesario correr geles de agarosa para comprobar el resultado
- Mayor rapidez y eficiencia en este tipo de PCR en comparación con el de punto final
Aplicaciones
- Analisis de expresion
- Cáncer
- Investigación -> detección de polimorfismos asociados a enfermedades. Estudios de asociación caso-control.
- Diagnóstico de enfermedades
- COVID (SARS-COV2)
