W2 HC.6 Next Generation Sequencing

Question 1

Hoeveel H-bruggen heeft A-T en hoeveel G-C. Welke is sterker?

Answer 1

A-T baseparing: 2 H-bruggen
G-C baseparing: 3 H-bruggen (dus sterker)

Question 2

Hoe verloopt de PCR (polymerase chain reaction): DNA vermenigvuldiging?

Answer 2

1. Een dubbelstrengs DNA molecuul gaat uit elkaar door temperatuurverhoging
2. De temperatuur gaat weer omlaag en primers (als starters) die complementair zijn aan een stukje van het template DNA worden toegevoegd
3. Basen worden toegevoegd
4. DNA-polymerase wordt toegevoegd
5. Twee nieuwe DNA-strengen worden gemaakt

Deze cyclus wordt bv. 30x herhaald. Dit leidt tot een DNA-amplificatie van 30: 2x10^30 moleculen - meer dan een miljard DNA-moleculen

Question 3

Waar is sequencing goed voor?

Answer 3

Met DNA sequencing wordt de volgorde van de 4 nucleotiden (basen) bepaald waaruit het DNA molecuul bestaat.

Question 4

Wat zijn voorbeelden van toepassing DNA-sequencing in de oncologie?

Answer 4

• Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B)
• Therapiekeuze (therapie A of B)
• Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
• Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen) ism klinische genetica
• Weefselindicatie (weefsel van pt A of pt B)

Question 5

Eigenschappen Next Generation Sequencing (NGS)?

Answer 5

• single molecule
• massively parralel
• twee vormen

Question 6

Hoe werkt Targeted NGS (amplicon enrichment)

Answer 6

• Er wordt een specifiek deel van het genoom gesequenced.
• Aan de PCR primers kunnen labels worden gehangen, die worden mee gesequenced.
• Zo kunnen dezelfde gebieden bekeken worden van verschillende individuen. Met behulp van de labels blijft duidelijk wat van welke patiënt is. Deze methode is efficiënt, maar er is wel continu maar één fragment uit een bepaald gebied wat gesequenced wordt.

Question 7

Hoe werkt Hybridization enrichment (hybridisatie verrijking)?

Answer 7

• Het DNA wordt in kleine fragmenten gesplitst voor het geamplificeerd wordt. Vervolgens worden adapters aangebracht voor latere sequencing.
• Interessante gebieden worden eruit gehaald door target specific probes (captured) en kunnen gesequenced worden.
• Deze methode is minder efficiënt, maar er kunnen wel meerdere fragmenten van een bepaald gebied gesequenced worden.

Question 8

Stappen van sequencing na het verkrijgen van de fragmenten:

Answer 8

1. Framents
2. Adaptoren toevoegen aan de fragmenten
3. De fragmenten met adaptoren hechten aan de flowcell
4. Vervolgens binden de fragmenten ook aan de primers op de flowcel
5. PCR extensie
6. De dubbele strengen maken zich los / dissocieren
7. Er ontstaat cluster formatie
8. Sequencing kan beginnen
9. Signaal scannen

Question 9

Wat is VAF? Variant Allel Frequentie?

Answer 9

Aantal malen dat een variant op een specifieke positie gevonden is t.o.v. referentie

Afhankelijk van: gen (oncogen vs tumor-suppressor-gen) en tumorcelpercentage

Question 10

Wat is de coverage (deep sequencing)?

Answer 10

Aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is. Hoe hoger de coverage hoe ‘deeper’ gesequenced

Whole Genome Sequencing (WGS) of Whole Exome Sequencing (WES) < 100 x deep

Targeted sequencing (honderden tot enkele duizenden fragmenten): 500x - tienduizenden x deep

Question 11

Conventionele sequencing vs next generation sequencing?

Answer 11

Conventionele Sequencing (Sanger)
- mix van moleculen
- 1 fragment/analyse
- output max van 1000 basen
- veel DNA nodig
- geringe hoeveelheid (20%)
- 1 sample (poolen niet mogelijk)
- eenvoudige analyse

Next Generation sequencing
- single molecule
- duizenden fragmenten/analyse
- output van 1-20x10^9 basen
- weinig DNA nodig (20ng)
- hoge gevoeligheid (1-2%)
- poolen van samples (barcode)
- bio-informatica nodig