HC. 7 - Proteomics, Metabolomics, microRNA, siRNA

Question 1

Wat is proteomics?

Answer 1

Techniek om direct de actieve eiwitten te meten van een patient

Question 2

Waarom proteomics?

Answer 2

Hoeveelheid eiwit is betere maat voor genexpressie dan mRNA. Zo kun je ook specifieker de eiwit analyseren, dus dan kan je kijken naar:
1. Eiwit-identificatie
2. ““-modificatie
3. ““-interactie

Question 3

Hoe wordt eiwit-identificatie uitgevoerd via proteomics?

Answer 3

Stappen:
1. eiwit of eiwitmengsel wordt gefragmenteerd door trypsine digestie
2. Hierna worden de stukjes geanalyseerd dmb massa spectrometrie
3. Hierna worden de massa’s vergeleken met de bestaande data van de humane genoom
4. En hierdoor krijg je de identificatie van het eiwit door een match te krijgen

Question 4

Wat is een tryptische fragment?

Answer 4

Een stukje eiwit dat kleiner is gemaakt dmv trypsine

Question 5

Wat is MALDI-TOF?

Answer 5

De methode voor massa spectrometrie

Question 6

Maar je hebt dat de molecuulmassa via massa spectrometrie, hoe weet je dan welke eiwit het is?

Answer 6

Dit komt omdat alle mogelijke eiwitten al via the human genome project zijn bepaald, en opgeslagen zitten in een database. In deze database staan ook alle mogelijke tryptische fragmenten, en van deze fragmenten zijn ook de molecuulmassa’s berekend. Dus dan vergelijk je gewoon de 2 en dan heb je een match.

Question 7

Wat kun je dan allemaal via massa spectrometrie?

Answer 7

1. Eiwit identificeren
2. Eiwit kwantificeren, lastiger, maar als je weet hvl je erbij zet kun je het kwantificeren.
3. bindende eiwit identificeren
4. Eiwit modificaties identificeren

Question 8

Hoe bindende eiwit identificeren? (stappen)

Answer 8

1. Antilichaam toevoegen die dat specifieke eiwit herkent en bindt. en de andere kant van antilichaam bindt je aan iets onoplosbaar (Immunprecipitatie)
2. Dan spoel je alles weg, zodat de niet gebonden eiwitten weggaan.
3. En zo zie je welke eiwitten interactis hebben met welke andere eiwit

Question 9

Hoe werkt eiwitmodificaties identificeren (stappen)?

Answer 9

Eiwitmengsel -> trypsine digestie (EVT -> verrijken voor fosfopeptiden) -> identificeren massa spectrometrie

Question 10

Hoe zie je dan bij eiwitmodificaties dat een eiwit gemodificeerd is?

Answer 10

Je hebt alsnog dat database, daarmee kun je bv zien dat een eiwit een fosfaat groep extra heeft. Als je dan een bepaalde proteine kinase remt en er zijn opeens niet meer dat specifieke eiwit met extra fosfaatgroep erop, dan weet je dat die specifieke eiwit een fosfaatgroep kreeg van die specifieke proteine kinase. En heb je dus eiwitmodificaties geidentificeerd

Question 11

Wat zijn metabolomics?

Answer 11

Analyseert welke metabolieten voorkomen in bijv. het bloed

Question 12

Stappen van metabolomics?

Answer 12

1. Stappen met sample (bv bloed)
2. Massa spectrometrie (positieve lading van maken en laten vliegen)
3. Identificatie via computer (database)
4. Herkennen van patroon (samenstelling zoeken )
5. Wat is de biomarker

Question 13

Waarom is mRNA niet altijd voorspellend voor eiwit(activiteit)

Answer 13

Er kan nog veel plaatsvinden tussen mRNA naar proteine:
1. Translatie controle -> meer of minder overgeschreven
2. proteine kan nog afgebroken worden
3. Activiteit van proteine synthese kan nog geregeld worden door modificatie van eiwitten, zoals: fosforylering

Question 14

Hoe kan translatie gereguleerd worden?

Answer 14

Er zijn genen in het DNA, die niet coderen voor eiwitten, maar voor korte stukje RNA, die de translatie van mRNA beinvloeden

Question 15

Hoe heten de korte stukjes RNA die de translatie van mRNA beinvloeden?

Answer 15

microRNA’s (miRNA)

Question 16

Wat doen miRNA?

Answer 16

Die kan ingebouwd worden in een complex, miRISC.

Question 17

Wat kan miRISC doen

Answer 17

Kan binden aan de 3’ kant van mRNA molecuul, en dit verminderd de translatie van de mRNA

Question 18

Hoe worden de miRNA’s gemaakt? en hoe wordt hier miRISC van gemaakt en de mechanisme kort daarna?

Answer 18

Genen in DNA, die genen worden afgeschreven -> dat stukje wordt geknipt door Drosha -> Deze kortere stukjes gaan naar de cytoplasma en worden hier nog kleiner geknipt door Dicer -> hieronder staat dan miRNA (Dubbelstrengs miRNA) -> 1 streng dat ingebouwd wordt op miRISC -> en als deze streng een complementaire streng tegenkomt bindt het daarop -> remt de translatie van die streng

Question 19

Kort wat doet drosha?

Answer 19

Knippen stuk genen in DNA

Question 20

Kort wat doet Dicer?

Answer 20

Knippen van al een geknipte stuk genen vanuit de DNA

Question 21

Welke nog kortere soort RNA bestaat er?

Answer 21

siRNA (short interfering RNA)

Question 22

Waar is siRNA voor?

Answer 22

T komt voor uit een beschermingsmechanisme tegen indringende virus dubbelstrengs RNA. Als dit gebeurd worden deze dsRNA geknipt door dicer om er siRNA van te maken.

Daarna wordt siRNA ingebouwd in RISC complex, waarna de mRNA wordt afgebroken / niet tot expressie wordt gebracht

Question 23

Hoe kun je siRNA gebruiken tegen kankercelgroei? (RNA interferentie / RNAi?)

Answer 23

Als je mRNA kan stoppen, stop je dus ook eiwit. siRNA zorgt voor mRNA afbraak. DUS RNA interferentie (RNAi)

Question 24

Hoe wordt er gescreend met RNAi om kankercellen te vinden?

Answer 24

1. siRNA maken voor veel genen, met elk een aparte celkweek
2. In elke celkweek wordt 1 gen uitgeschakeld
3. Je analyseert effect behandeling
4. Kijken welke siRNA celdood geven bij kankercellen en niet voor normale cellen
5. Controleer of er al remmers voor deze targets aanwezig zijn
6. Controleer of die remmers werken in cellen en diermodellen