Bio Mol II Examen 2

Question 1

Enzymes polymérases thermostables populaires

Answer 1

Taq, Pfu, Vent.

Question 2

Taq vs Pfu vs Vent

Answer 2

Taux d’erreur:
Pfu < Vent < Taq
à cause des exonucléases 3’ vers 5’ (proof-reading)

Vitesse
Pfu < Vent < Taq

Question 3

trois phases d’une PCR classique

Answer 3

1.Dénaturation à 95C

2.Amorcage (Hybridation) à 55C

3.Polymérisation (Élongation) à 72C

(4. Électrophorèse)

Question 4

1.Dénaturation role:

Answer 4

Provoque la séparation des deux brins de tous les fragments d’ADNdb en ADNsb.

Question 5

Amorcage (Hybridation) rôle:

Answer 5

Permet aux amorces de s’associer par complémentarité aux régions du fragment d’ADN que l’on veut amplifier.

Question 6

Polymérisation (Élongation) rôle:

Answer 6

C’est la réplication du fragment d’ADN à partir des amorces
avec l’intervention de l’ADN polymérase.

Question 7

Le fragment amplifié suivant une PCR se nomme l’_____

Answer 7

amplicon

Question 8

2 tampons 10X:

Answer 8

• Tris-Cl: pH: 8,3 qui sert à tamponner le milieu réactionnel au niveau optimal pour l’activité de la Taq polymérase
• MgCl2: l’ion Mg2+ est un cofacteur essentiel à la Polymérase. Ce cation bivalent interagit également avec les charges négatives de la chaîne d’ADN, limitant ainsi les forces de répulsions entre brins d’ADN et favorisant donc la stabilité de l’hybridation.

Plus sa concentration est grande, plus l’hybridation est facilitée que celle-ci soit spécifique ou non. Une trop forte concentration peut alors conduire à une augmentation des signaux aspécifiques.

Question 9

3 Polymérases modifiées :

Answer 9

“Long-Range”, “Hot-Start” et “High-Fidelity”

Question 10

équation de température d’appariement :

Answer 10

Tm = [ 4°C x (# de G et C) ] + [ 2°C x (# de A et T) ]

Question 11

quelle est le Tm de 5’ - ATCGATCGATCG - 3’

Answer 11

Tm =

Question 12

Amorce idéale

Answer 12

1. 50% de GC et AT
2. soit un G ou un C en 3’
3. un Tm rapporché

Question 13

SYBR green vs BrEt

Answer 13

BrEt est toxique et mutagène

Question 14

Applications de PCR

Answer 14

1.Caractérisation (# de pb et séquencage)
2. Clonage par PCR (ADNc et ADNg)
3.Quantification (PCR à temps réele, Qté rélatif et Qté absolue)

Question 15

rôle de l’échelle

Answer 15

savoir la taille moléculaire

Question 16

PCR niché rôle

Answer 16

PCR dans une PCR. On a deux jeux d’amorces un interne et un externe pour amplifier les séquences en faible concentration.

Question 17

séquencage par PCR

Answer 17

PCR avec des faibles concentrations de ddNTPs sans hydroxyle 3’ pour achever la synthèse par polymérase pour voir où toute les Gs sont, la les Cs la les As et la les Ts. par rapport aux taille moléculaires.

Question 18

séquencage automatique

Answer 18

utilisation de 4 fluorophores détecté par une machine sous forme de pics

Question 19

next gen sequencing

Answer 19

bio-informatique qui te dit le séquences

Question 20

Isolement direct d’un section spécifique de l’ADN génômique par PCR (3étapes)

Answer 20

1. ajouter des séquences de restrictions sur les amorces ajouté pour pouvoir couper ces séquences (assurer que la séquence d’intérêt ne comporte pas ces sites de réstrictions)
2. insert dans une vecteur plasmide
   3.proliferation dans les cellules E.coli

Question 21

RT-PCR steps (4)

Answer 21

1.Amorcage( Hybridation)
2.Élongation (par reverse transcriptase capable de transcrire les 3.ARNm avec des dNTPs (ADN) )
Inactivation (inactiver le reverse transcriptase avec des ARNases pour cesser la transcription de l’ARNm pour qu’il ne competitionne pas avec le taq dans l’étape 4)
(1 CYCLE)

4.PCR classique
(~30 cycles)

Question 22

d’ou vient les reverse transcriptases

Answer 22

les rétrovirus

Question 23

combien d’amorces pour un RT-PCR?

Answer 23

3,
-un pour l’ARNm
-un antisens pour l’ADNc
-un sens pour l’ADNc

Question 24

amorces pour le première étape du RT-PCR

Answer 24

soit, un amorce poly-dT (non-spécifique à un ARNm)
ou une amorce spécifique

Question 25

drawback de l’RT-PCR et comment les fixer.

Answer 25

L’ADN génomique peut entrer en compétition avec l’ADNc lors de l’étape d’hybridation.

1 - On peut régler cela en mettant l’amorce sur deux exons différentes séparé d’un intron et de les différencier selon leur taille lors de l’électrophorèse

2 - Ou bien, les ARNm eucaryotes polyadénylés peuvent être purifiés par chromatographie de l’ARN cellulaire total sur une colonne où sont immobilisés des oligo-dT (oligonucléotides constitués de désoxythymidines).

Question 26

deux types de PCR quantitative

Answer 26

• gel (radioactif, BrEt, SYBR green)
• PCR en temps réel
  – SYBR Green
  – Taqman
  – Balise moléculaire

Question 27

deux types de PCR multiplex

Answer 27

– quantification absolue
– quantification relative

Question 28

PCR vs PCR en temps réele

Answer 28

À la différence d’une PCR classique, la PCR en temps réel utilise un marqueur fluorescent qui permet un suivi de la réaction et la quantification de l’amplicon synthétisé en temps réel
Cette technique permet de faire une quantification relative de gènes d’intérêts dans des échantillons donnés par rapport à un gène de référence non régulé (non-inductible). Il permet aussi de faire une quantification absolue (détermination en nombre de copies) par rapport à un standard externe

Question 29

quelles axes ont le PCR à temps réels?

Answer 29

y = Niveau de fluorescence
x = # de cycles

Question 30

PCR à temps réel -
TaqMan vs SYBR green

Answer 30

Avantage du TaqMan
-spécifique à une séquence (moins de fausse positifs)

Avantages du SYBR green
-pas besoin de designer un troisième amorce avec quencher(3’) et rapporteur(5’)

Question 31

TaqMan déroulement:

Answer 31

ajout d’une sonde dans ton séquence d’intérêt pour que la Taq lui dégrade lors de l’élongation qui va séparer le Q du R pour faire briller le R. La fluorescence est quantifié pour évaluer le Ct nécessaire pour que chaque échantillon atteignent un niveau définit de fluorescence.

Question 32

balise moléculaire :

Answer 32

similaire au Taqman mais il brille pendant l’amorcage (l’étape d’hybridation) puisque le Q et R se retrouve proche l’un de l’autre car il est en conformation épingle à cheveux et lorsqu’il s’apparie, les boutes 5’ et 3’ sont éloigné assez pour briller

Question 33

La PCR multiplexe:

Answer 33

un protocole de PCR destiné à amplifier plus d’un amplicon
à la fois, généralement en ajoutant plus d’une paire d’amorces. Les produits de PCR seront alors compétitifs pour la polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN.

Ces applications sont très utiles lors de la quantification relative de produits lorsqu’on amplifie un transcrit non inductible (actine) en parallèle avec un transcrit d’intérêt inconnu.

Question 34

Comment détecter des mutations avec PCR par SNP

Answer 34

(Single Nucleotide Polymorphism) - faire une PCR avec deux séquences Taqman

ex :
sonde 1 (séquence wt) (R va briller vert)
R 5’-GATACA G ATACA-3’ Q

sonde 2 (séquence muté) (R va briller bleu)
R 5’-GATACA T ATACA-3’ Q

Si c’est bleu, un mutation est présent

Question 35

étapes pour la construction d’une banque d’ADNc à l’aide du phage lambda (11 steps)

Answer 35

1. isoler tout l’ARNm d’un type cellulaire
2. Une transcriptase inverse, est utilisée pour synthétiser un brin d’ADN complémentaire de chaque molécule d’ARNm, en commençant par une amorce d’oligo-dT. Les ARNs (ARNm, ARNt et ARNr) son détruites par ARNases
3. Une séquence poly-G est ajoutée à l’extrémité 3’ (linker) à l’aide d’une enzyme spécialisée appelée TdT. Cette enzyme recombinante permet le marquage des extrémités 3’-OH d’ADN fragmentés linéaires.
4. Tous les ADNc sont par la suite hybridés avec une amorce oligo-dC.
5. Suite à l’amorçage, tous les ADNc sont rendus doubles brins grâce à une ADN polymérase (Chaque ADNc double brin contient une région double brin oligodC - oligo-dG au niveau 5’ et une région double brin oligodT - oligo-dA à l’extrémité 3’.)

6.Les ADNc doubles brins sont par la suite méthylés afin des protéger contre des traitements aux endonucléases

7. de courtes molécules d’ADN doubles brins contenant le site de reconnaissance d’une enzyme de restriction particulière sont ligaturées aux extrémités des ADNc à l’aide de l’ADN ligase T4

8a. Ces molécules résultantes sont ensuite traitées au moyen d’une enzyme de restrictions spécifique du linker attaché, produisant des molécules d’ADNc avec des extrémités collantes de chaque côté

8b. Lors d’une autre procédure, l’ADN de l est d’abord traité à l’aide de la même enzyme de restrictions pour produire des fragments avec des extrémités complémentaires aux bouts des inserts

9. Les bras de l et l’ensemble des ADNc, contenant tous des extrémités collantes complémentaires sont ensuite mélangées et reliées covalemment par l’ADN ligase
10. Chacune des molécules résultantes d’ADN recombinant contient un ADNc situé entre les deux bras de l’ADN du vecteur l. Les virions contenant les ADN recombinants ligaturés sont ensuite assemblés in vitro
11. Seules les molécules d’ADN de la taille correcte peuvent être empaquetées afin de produire des phages l recombinants infectieux. Les phages l recombinants sont par la suite étalés sur un tapis de E. coli afin de former un grand nombre de plages de lyses individuelles

( Chaque plage de lyse correspond à un seul phage recombinant, c’est pourquoi tous les phages l descendants qui se développent sont génétiquement identiques et constituent un clone portant un ADNc dérivé d’un seul ARNm.)

• (L’ensemble de ces clones constitue une banque d’ADNc)

Question 36

cosmide:

Answer 36

-(hybride de phage lambda et plasmide)
-(plus longue qu’une plasmide (il est de 35kb-45kb) )
-(Utilisé pour créer des banques d’ADN)
- forme pas des plages de lyse comme les virions

Question 37

cosmide anatomie:

Answer 37

origine de réplication,
ungène de résistance
et
une séquence polylinker

Question 38

read notes and maybe pwrpoints too :)

Answer 38

do it!