ELISA och CLIA

Question 1

Vad kan ELISA användas till?

Answer 1

Kan användas för att detektera både antigen och antikropp
EX. bestämning av serumantikroppar för HIV
Vid detektion av virusantigen tex, hepatit
mycket känslig metod

Question 2

Vad använder man mest som antikroppar för ELISA ?

Answer 2

• Oftast används monoklonala antikroppar= specifika ak som binder till en del av antigenet
• Polyklonala antikroppar= mulitpla ak som binder till samma antigen

Question 3

Finns olika varianter av ELISA vilka ?

Answer 3

• sandwich
• direkt
• indirekt
• kvalitativ /kvantitativ

Question 4

Kort- Hur sker framställning av monoklonal antikropp?

Answer 4

B-cellshybridomen överlever i HAT medium, delar sig obegränsat och bildar antikroppar

Question 5

Hur sker val av antigen ?

Answer 5

• > val av antigen tex. virus, proteiner, toxiner eller hormoner
• > kan vara antikroppar

Question 6

Kortfattat hur sker ELISA metoden ?

Answer 6

• Coatning av platta (antigen/antikropp)
• Blockering
• Tillsättning av prov
• Detektionsantikropp
• Substrat
• Avläsning

Question 7

Vad används för platta för ELISA metoden ?

Answer 7

• 96 hålls platta

- gjord av plast, som binder proteiner effektivt

Question 8

Vad för Coatnings-buffert används ?

Answer 8

• Fosfatbuffert (PBS) eller karbonatbuffert
• Buffert som inte denaturerar antikropp/antigen, samtidigt som bindningen maximeras (oftast karbonatbuffert)
• pH är viktigt

Question 9

Vad för blockering kan användas ?

Answer 9

Såsom= 1% PBS, 1% torrmjölk eller 10% kalvserum

Question 10

Vilket steg är viktigt att göra efter blockering ?

Answer 10

• Tillsätt ev standard, kontroller + prover

- Vid antigenmätning är prover ofta supernatanter från cellodling, eller serum/plasma från patienter

Question 11

Vad för spädning och kontroller används ?

Answer 11

• spädningen görs genom att späda i tween

- +/- kontroller

Question 12

När används standard kurvan? Vad innehåller standard kurvan

Answer 12

• Används när antigenkoncentration ska mätas
  (Sandwich- eller inhibitions-ELISA)
• Seriespädning av en känd koncentration av
  antigenet som ska mätas
• Koncentrationen plottas mot absorbansen

Question 13

Vad är detektionsantikropp?

Answer 13

• Vanligen konjugerad med ALP eller HRP
• Mus, råtta, kanin, get, får, häst
• Monoklonal eller polyklonal
• Koncentration antikropp

Question 14

Ge ett exempel på detektions antikropp och hur den fungerar ?

Answer 14

• Avidin – kommer från ägg
• Avidin har väldigt hög affinitet för biotin (B
  vitamin)
• Detektionsantikroppen är konjugerad med
  biotin
• Enzymet är konjugerat med streptavidin
• Späd detektionsantikropp i blockeringslösning
  med Tween

Question 15

Vad är ELISA känsligheten beroende utav?

Answer 15

-> Känsligheten är beroende av vilket antikroppspar som används
-> Känslighet = den lägsta antigenkoncentrationen
som kan mätas, som ger högre absorbans än
negativ kontroll

Question 16

Hur fungerar direkt ELISA ?

Answer 16

• Bindning av ak/ag direkt till botten i brunnen

- Märkt primärantikropp
- Substrat

Question 17

Vad finns det för fördelad/nackdelar av direkt ELISA ?

Answer 17

Fördelar 
- snabb 
- liten risk för korsbindning 
Nackdelar 
- märkte primär ak 
- dyrt och tidskrävande 
- lägre flexibilitet

Question 18

Hur fungerar indirekt ELISA ?

Answer 18

• Vanligen detektion av antikroppar

- Coatad med antigen i botten
- Prover innehållandes eventuella antikroppar

Question 19

Vad finns det för fördelar/nackdelar med indirekt ELISA ?

Answer 19

Fördelar:
- Stor variationsmöjlighet
- Många kommersiella märkta sekundär ak 
tillgängliga
- Ingen märkning av primärantikroppen
Nackdelar:
- Korsreaktioner kan förekomma
- Extra inkubationssteg krävs

Question 20

Hur fungerar sandwich ELISA ?

Answer 20

• Två olika antikroppar behövs
• Måste känna igen olika epitoper på antigenet
• Första antikroppen: “Capture Ab”
• Andra antikroppen: “Detektionsantikropp”
• Ofta: detektionsantikroppen är biotin-märkt
• Vanliga enzymer: HRP (Horse Radish
  Peroxidase) och ALP

Question 21

Hur fungerar kompetitiv ELISA ?

Answer 21

• Solid fas med ak
• Okänd mängd omärkt ag + känd mängd märkt ag
• Enzymaktivitet proportionell mot mängd bundet
  märkt ag
• Fördelar: vid komplexa mixer – kräver ej rening
• Nackdelar: varje ag kan kräva olika metoder

Question 22

Vad kan det finnas för felkällor vid ELISA?

Answer 22

• Positiv- negativkontroll: otillräcklig tvättning,
• Negativ- positivkontroll: ej korrekt coating,
• Svag signal: ej riktig tvättning,

Question 23

När använda dataanalys titer?

Answer 23

-> Titer används när man inte kan göra en koncentrationsbestämning (mätning
av specifika antikroppar)
-> Titer = Den inverterade spädningen där provet har högre signal än
bakgrunden

Question 24

Vad finns det för alternativ metod till ELISA ?

Answer 24

CHEMILUMINESCENCE 
IMMUNOASSAY, CLIA
• Mkt vanlig metod som alternativ till ELISA
• Stora variationsmöjligheter
• Hög känslighet
• Snabb