Virologisk molekylär diagnostik

Question 1

Vad är traditionell virusdiagnostik ?

Answer 1

• virusodling
• antikroppar
• påvisning via elektronmikroskop

Question 2

Vad är herpes virus (HSV) och vad är varicella-zostervirus (ZVZ)

Answer 2

• > Finns herpes virus 1 och 2. Orsakar blåsor runt munnne (munsår)
• > ZVZ virus orsakar bla. vatten koppor som orsakar blåsor runt om på kroppen

Question 3

Vad är Cytomegalovirus (CMV) ?

Answer 3

• kan ge körtelfeber på immunkompetenta

- kan allvarlig sjd hos transplanterade och andra immunsupprimerade. Så som feber, hepatit eller colit.

Question 4

Vad är Epstein-barrvirus (EBV)?

Answer 4

• körtelfeber hos immunkompetenta
• feber, hepatit och PTLD hos immunsupprimerade
• kvantifiering av EBV-DNA i blodet.

Question 5

Vad är hepatit- C virus (HCV)

Answer 5

> > Kan orsaka kronisk inflammation, skrumplever och levercancer
Genotypning före behandling
HCV-RNA-analys för att bedöma behandlingseffekt

Question 6

Vad är hepatit-B virus (HBV)

Answer 6

> > Kan orsaka kronisk inflammation, skrumplever och levercancer
HBV-DNA-kvantifiering för att bedöma prognos eller levercancer
Genotypning inför behandling
Sekvensering – molekylär epidemiologi

Question 7

Vanliga luftvägsinfektioner ?

Answer 7

• Rhinovirus = 40-50%
• coronavirus = 15%
• Influensa A och B = 5-10%

Question 8

Vad finns det för gastroenteriter ?

Answer 8

• > virus: rotavirus, calici virus, adeno virus, astrovirus
• > Bakterier: Shigella, Salmonella, V cholerae.
• > Protozoer: Cryptosporidium, Giardia

Question 9

Vad är HPV (humant papillomvirus) ?

Answer 9

• 100 kända subtyper- 30 genitala subtyper
• 14 subtyper associerade :ll livmoderhalscancer (cervixcancer)
• > HPV testning införs om primärscreening 2019

Question 10

Vad har PCR för svagheter?

Answer 10

• Specificiteten osäker
• Specificiteten osäker
• Kontamina,onsrisk
• Kvan,fiering krånglig och inexakt

Question 11

Vad finns det för fördelar med realtids PCR?

Answer 11

• Hög specificitet = prober ger 100% säkerhet
• Hög sensi,vitet
• snabb
• Minskad kontaminationsrisk
• Möjligt att kvantifiera och typa
• Utveckling/optimering av PCR

Question 12

Vad är Taqman-probe (hydrolysprobe)?

Answer 12

• Fluorescensen låg om proben är intakt
• Binder till utvidgade fragment
• Bryts ner av polymeraset: = fluoroscens

Question 13

Hur fungerar kvantifiering av..

• Ct-värdet för varje prov ?
• Ct-värdet för co-amplifierat ?

Answer 13

> > Ct-värdet för varje prov relateras till en standardkurva. Denna kurva utgår efter seriespädning av kända koncetrationer.
Ct-värdet för co-amplifierat DNA/RNA är relativ kvantifiering, skillnad i Ct-värdena

Question 14

Vad innebär typning ?

Answer 14

• Om en probe inte passar perfekt blir bindningen och fluorescensen svag.
  (Flera prober mot samma område –> typning)
• Om en primer inte passar i 3-ändan blir amplifieringen dålig
  (primrar med olikheter i 3-> typning

Question 15

Hur fungerar digital PCR?

Answer 15

• Provet späds och fördelas på många PCR-reaktioner.
• 20,000 taqman-reak,oner à 1 nL
• Varje reak,on avläses + eller –
• Kan göras i emulsion eller chip
• baserat på relationen +/- reaktioner kan koncentrationen beräknas.

Question 16

Varför ska man använda sig av digital PCR?

Answer 16

• Absolut kvantifiering med högre precision
• Påvisa fraktioner med resistensmutationer
• Kvantifiera standarder
• Forskning

Question 17

Vad innebär en sekvensering ?

Answer 17

• Identifiering av virus och bakterier
• Genotypning
• Molekylär epidemiologi (smittspårning, analys av epidemier)
• Resistensmutationer (HIV, HBV, HCV)

Question 18

Vad innebär Kedjestoppssekvensering (Sanger) ?

Answer 18

• Oftast PCR först
• Ibland kloning
• ”Cycle sequencing” för att skapa alla längder (stoppnukleotider)
• Avläsning med elektrofores

Question 19

Hur är arbetsflödet av sangerssekvensering?

Answer 19

• PCR, kolla band
• (rening)
• Cyklisk sekvensering, kolla band
• (rening)
• Läsning i instrument
• Visuell koll av sekvensen, redigering, tolkning

Question 20

Vad har sangerssekvensering för begränsningar ?

Answer 20

• Svårt om koncentra,onen är låg eller om virus är mycket variabelt (svagt eller inget band)
• Annat DNA kan ha amplifierats, vilket ger ett brus med extrakurvor i krommatogrammet.
• Tidskrävande om man vill ha hela virus, nästan omöjligt a] få humant genom

Question 21

Vad påverkas selektion av?

Answer 21

• Genetisk barriär
• Fitness: (Hur väl kan muterat virus replikera? )
• Kompensatoriska mutationer (Kan fitness förbättras genom andra mutationer? )

Question 22

Varför gör vi smittspårning?

Answer 22

• Källan till ett utbrott (livsmedel, vatten)
• smittkedjor
• enskilt fall (sexuell överföring)

Question 23

Vad innebär fylogeni?

- olika slags träd?

Answer 23

• > jämförelse av sekvenser för att försöka förstå hur det utvecklas.
• > finns olika matematiska modeller
• > fylogenetiskt träd finns två sorter: rotat och orotat

Question 24

Vad innebär “reads” som bildas vid MPS/NGS körning?

Answer 24

• varje körning ger massor av “reads”, alltså avlästa sekvenser som är 200-400nt.
• Dessa reads jämförs med varandra och ofta med referenssekvenser för att fogas samman.
• Varje position finns ofta i många reads. Detta “djup” påverkar hur säkert positionen kan bedömas.