Kapitel neun

Question 1

9.1 Was passiert beim „Aussalzen“ einer Proteinlösung? Begründen Sie.

Answer 1

Unter „Aussalzen“ versteht man die Ausfällung von Proteinen durch Zugabe von Salz. Die Proteine aggregieren aufgrund der Abschirmung der elektrostatischen Wechselwirkung in Salzlösung sowie durch Veränderung der Löslichkeit durch Dehydration.

Question 2

.3 Welche Methode gehört jeweils zu den folgenden Trennungskriterien:
a. Molekülgröße:_____________________________________
b. Oberflächenladung:________________________________
c. Sedimentationskoeffizient:_________________________
d.
Bindungseigenschaften des Proteins:_______________________

Answer 2

a. Gelpermeationschromatographie
b. Ionenaustauschchromatographie
c.
Zentrifugation
d. Affinitätschromatographie

Question 3

9.4 Bei der SDS-PAGE wandert ein einkettiges 90 kDa Protein langsamer als ein 40 kDa Protein. Dagegen tritt ein 90 kDa Protein aus einer Gelfiltrationssäule zuerst aus. Begründen Sie diesen Unterschied. (9.2 Was versteht man unter Gelfiltration?)

Answer 3

Beide Methoden trennen Moleküle nach Molekulargewicht in siebenden Medien.
Bei der SDS-PAGE handelt es sich um eine Elektrophorese-Methode in vernetzten Polyacryamid-gelen. Kleine Moleküle wandern in dieser poröse Matrix schneller als große. Das 90 kDa Protein wandert daher langsamer als das 40 kDa Protein. Das Detergenz Natriumdodecylsulfat denaturiert die Proteine und verleiht allen Proteinen soviel negative Ladung, dass deren Wanderungsgeschwindigkeit und damit ihre Trennung von ihrer Eigenladung unabhängig ist.
Als Gelmatrix bei der Gelfiltration werden kugelförmige Polymere verwendet, die in Abhängigkeit ihres Vernetzungsgrades porös sind. In die Poren dieser Matrizes können kleinere Proteine geeigneter Größe eindiffundieren. Ihre Durchflußgeschwindigkeit durch das Gel verlangsamt sich dadurch. Sind die Proteine zu groß, so eluieren sie an den Poren vorbei mit höherer Fließgeschwindigkeit durch das Gel. Das 90 kDa Protein eluiert daher zuerst

Question 4

9.5. Bei welcher Chromatographie werden die an die Säule gebundenen Proteine mit einem abnehmenden Salzgradienten eluiert.

Answer 4

Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC)

(- hohe Salzkonzentration: Oberflächenladung der Proteine wird abgeschirmt und
Hydrathülle entfernt (analog zum Aussalz-Effekt)
- Proteine wechselwirken über hydrophobe Wechselwirkungen mit der hydrophoben
stationären Phase
- durch abnehmenden Gradienten wird die Bindung zur stationären Phase
kontinuierlich schwächer und das Protein eluiert)