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Flashcards in Methoden 3 Deck (22):
1

Welche Infos erhält man durch die FTIR-Spektroskopie?

über alles, was Schwingungen enthält:
Art d. Bindung, Gewicht d. Atome
Anordnung d. Atome
WW mit Nachbaratomen

2

Was ist das allgemeine Messprinzip spektroskopischer Verfahren?

Den untersuchten Molekülen wird Energie zugeführt. Diese versuchen, die Energie wieder loszuwerden.
Messziel: Energie verbrauch oder Details über Energie Abgabe

3

Wie kann Molekülen Energie zugeführt werden?

Ladung in Bewegung setzen (Elektronen, Kerne)
Thermische Stöße (T-Erhöhung)

4

Anwendungen der Massenspektrometrie?

Anwendung: Bestimmung von GG-Konz.
Analyse von Molekülfragmenten (Ermittlung Schnittstellen v. Proteasen, Nukleasen, Glycosidasen)
Artbestimmung (Massenspektrum bei Bakterien Artspezifisch

5

Vor- und Nachteile der Massenspektrometrie?

Vorteile: Extrem genau, schnell, viele Anwendungen
Nachteile: bisher kaum auf Membranproteine Anwendbar, Proteine müssen erst ionisiert werden

6

Prinzip der MALDI- Matrix-Methode?

- Proteine werden auf UV-absorbierender Matrix mit UV-Licht bestrahlt
- Ladung entsteht beim Verdampfen und Photooxidieren d. Matrixmoleküle
-> auf Protein Übertragen

7

Prinzip d. Elektrospray Verfahrens?

- Proteinlösung durch Kapillare gepresst
- positiv geladene Kapillare überträgt Ladung auf Flüssigkeit
- nach Verdampfen d. Lösungsmittels ist d. Protein geladen.

8

Prinzip der UV-vis Spektroskopie

Probe und Kontrolle mit monochromatischem Licht bestrahlt
-> von Probe absorbiert
Menge des absorbierten Lichts wird erfasst und mit Kontrollprobe verglichen
-> misst Anregung der äußeren Elektronen
-> überführt HOMO zu LUMO

9

Wie sind die optimalen Messbedingungen für UV-vis?

- so viel Licht wie möglich, darf Probe aber nicht schädigen
- Spaltbreite so eng wie möglich, aber noch genügend Licht
- Lösungsmittel mit Bedacht wählen
- Probe nicht zu dick/dünn
- kühlen hilft manchmal

10

wie entsteht Bandenverbreiterung?

Doppler Effekt: überlagernde Molekülbewegungen (Kühlen hilft)
Lebensdauerverbreiterung: -absorbierte Lichtzüge haben endliche Länge
- je kürzer Messdauer/Anregungswelle, desto breiter die Bande

11

Prinzip des Isothermalen Titrations Kaloriemeters

Gemessen: Bindungsreaktion Rezeptor + Ligand
2 Kammern (1 mit Rezeptor, 1 Referenz)
- Ligand tropfenweise zugeführt -> reagiert u. bewirkt T Sprung (ΔH pro Tropfen benötigte Heizenergie)
- Temp in Referenzkammer wird el. nachgeheizt
- T sinkt danach wieder auf Thermostat-Wert
man erhält: ΔH, ΔS, ΔG, GG-Konst, Anzahl Bindungsstellen

12

Prinzip der Differential-Scanning Calorimetry

für Phasenübergänge u. Proteinfaltung
- Probe u. Referenz erwärmen
- reaktionsbedingte T-Asymmetrie wird über Zusatzheizen kompensiert

13

Vor- und Nachteile der Kaloriemetrie?

Vorteile: kein labeln, kein Fixieren d. Proteine
Info's ΔH, ΔS, ΔG, GG-Konst
automatisiert
Nachteile: mg-Mengen nötig
Systeme rauschanfällig -> Stöße von Luftbläschen

14

Was passiert beim Quenching?

Angeregte Teilchen geben die Energie nicht durch Emission (Fluoreszenz, Phosphoreszenz,...) wieder ab, sondern es kommt zu einer Intensitätsabnahme der Fluoreszenz, was zur Fluoreszenzlöschung (Quenching) führt, ohne dass dabei der Fluorophor zerstört wird.
internal conversion bis zum Grundzustand und FRET sind wohl auch Quenching-Effekte [FRET auf jeden Fall]

15

Was wird bei der Fluoreszenzspektroskopie gemessen?

Entweder die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der (während der Messung kontinuierlich verschobenen) Anregungswellenlänge
oder
die emittierte Fluoreszenzstrahlung einer Wellenlänge nach Anregung mit breitem Spektrum

16

Welchen Vorteil bringt die Messung der Emission statt der Absorption bei der Fluoreszenzspektroskopie für die qualitative Analyse von Proben?

Emission von Fluoreszenzstrahlung dauert länger als nur Absorption, weswegen Interaktionen der angeregten Teilchen mit der Umgebung während dieser Zeit Auskunft über die Umgebung geben können.

17

Wo liegen die Absorptionsmaxima von DNA/RNA und Proteinen?

DNA/RNA: 260nm
Proteine: 280nm

18

Was sind internal conversion und inter System crossing?

IC: Relaxation von Schwingungen + Rotverschiebung ohne Spin- Umkehr (10^-10 sec)
ISC: genauso, aber mit Spin Umkehr

19

Wie kann man mit IR Atomgruppen identifizieren?
Voraussetzung?

Über Gesamtmasse und Bindungskonstanten Vorraussetzung: Schwingungsffähiger Molekülbereich muss Dipol aufweisen

20

Wie funktioniert die Methode der Differenzspektren bei der IR?

Zum Nachweis von Kontaktstellen
Spektrum doppelt bestimmen (mit/ohne Ligand)
Differenz bilden
-> nur Kontaktpunkte die sich ändern tragen zur Differenz bei

21

Bei der Röntgenstrukturanalyse sind die Infos auf dem Beugungsschirm meist unvollständig. Wie wird das umgangen?

-Mehrfachaufnahme: Kristalle immer 2° drehen
-Schwermetalle als Orientierungshilfe einbauen
- gleichzeitig wenigstens 2 versch. räuml. versetzte Aufnahme Ebenen messen.

22

Vor- und Nachteile von NMR

Vorteile:keine Kristalle nötig
physiologische Lsg. nutzbar
Versch. Atome, die als Magnetsonden wirken können
Nachteile: indirekt, Struktur wird nicht aus Pos. Der Atome, sondern aus Nachbarschaftsbeziehungen abgeleitet.
Schwierig bei großen Proteinen.