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enzimología > tema 4 > Flashcards

tema 4 Flashcards

1
Q

características de un ensayo enzimático

A
  • alta especificidad: para detectar solo la enzima en la que estamos interesados
  • alta sensibilidad: para poder detectar la enzima en extractos donde haya baja concentración o este mezclada
  • alta precisión
  • metodología conveniente
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Q

tipos de ensayos enzimáticos

A
  • continuo
  • discontinuo
  • directo
  • indirecto
  • estado estacionario
  • estado preestacionario
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Q

define ensayo continuo

A

ensayo en el que se monitoriza la desparación del sustrato o la formación del producto

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4
Q

define ensayo discontinuo

A

ensayo en el que se producen distintas paradas a distintos tiempos de la reacción
y luego se determina la concentración de producto
se detiene la reacción mediante la introducción de sustancias desnaturalizantes, aumentando la temperatura, añadiendo secuestradores metálicos (metaloenzimas), con inhibidores, cambiando bruscamente el pH

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5
Q

¿cuál es la principal ventaja de los ensayos discontinuos?

A

debido a las paradas, se pueden usar técnicas más avanzadas (RMN, MS, radiactividad, cromatografía) que son útiles para la detección de actividad enzimática cuando hay baja concentración

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6
Q

¿cuál es la principal desventaja de los ensayos discontinuos?

A

más laboriosos, equipo mas sofisticado, personal especializado

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7
Q

define ensayo de estado estacionario

A

el estado estacionario es cuando se han formado todos los complejos ES
se detectan en los primeros minutos de la reacción
el método clásico es la determinación de la velocidad inicial

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8
Q

define ensayo de estado preestacionario

A

el estado preestacionario es cuando todavía no se han formado todos los complejos ES
se detecta en los primeros segundos de la reacción
se usan mecanismos automatizados y mecanizados

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9
Q

define ensayo directo

A

ensayo en el que se puede medir al concentración de sustrato o producto

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10
Q

define ensayo indirecto

A

ensayo en el que no se puede detectar la concentración de sustrato o producto y se requiere de una reacción acoplada para determinar la concentración de otra especie.
la enzima de la reacción acoplada debe de estar pura; la velocidad de esta debe de ser superior; la enzima debe de estar en exceso

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11
Q

lista de factores que afectan a un ensayo enzimático

A
  • pH
  • temperatura
  • grado de oxidación de la enzima
  • presencia de metales pesados
  • presencia de proteasas
  • polaridad del medio
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12
Q

efecto negativo y solución de la temperatura en un ensayo enzimático

A

efecto negativo: por encima o por debajo de la temperatura óptima, la enzima se desnaturaliza
solución: uso de dispositivos Peltier o de baños termostatizados

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13
Q

efecto negativo y solución del pH en un ensayo enzimático

A

efecto negativo: por encima o por debajo del pH óptimo, la enzima se desnaturaliza
solución: uso de sustancias tamponantes; la fuerza tamponadora depende de la concentración de la sustancia tampón; debe de tener un pKa adecuado (pKa es el logaritmo del valor de pH en el que este es estable)

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14
Q

efecto negativo y solución del grado de oxidación de la enzima en un ensayo enzimático

A

efecto negativo: precipitación y formación de agregados, debido a la presencia de -SH
solución: crear un ambiente reductor (ambiente con -SH): DTT, cisteína, glutatión reducido

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15
Q

efecto negativo y solución de la presencia de proteasas en un ensayo enzimático

A

efecto negativo: hidrólisis de la enzima
solución: inhibidores de proteasas (cóctel de inhibidores de distintas proteasas porque no sabes qué tipos de proteasas están presentes en el medio)

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16
Q

efecto negativo y solución de la polaridad del medio en un ensayo enzimático

A

efecto negativo: precipitación y formación de agregados (por la presencia de -SH)
solución: si el ambiente es hidrofóbico, añadir sustancias apolares (sacarosa, glicerol, DMSO, DFM); si el ambiente es hidrófilo, añadir sustancias polares (KCl, NaCl, NH4Cl)

17
Q

efecto negativo y solución de sustancias interferentes en un ensayo enzimático

A

efecto negativo: en extractos crudos, a parte de nuestra enzima, encontramos otras sustancias, como S no deseados o otras E. Obtenemos sobreestimaciones o infraestimaciones
solución:
- ensayos en blanco
- diluyendo los extractos para que las interferencias no sean apreciables
- purificando

18
Q

curva de avance de reacción

A

una curva de avance de reacción es una representación de la [ ] frente al tiempo
la concentración de producto y de sustrato son ambas proporcionales al tiempo en los primeros estadíos de la reacción, sirviendo para crear una curva de avanze de reacción cuya tangente se usa para calcular la velocidad
[S] y [P] son equivalentes, NO iguales
[ ] es proporcional al tiempo al principio, cuando la [ ] se va consumiendo ya no es proporcional

19
Q

efecto de la [E]

A

la [E] es proporcional a la velocidades iniciales, tienen una dependencia lineal:
v = kcat · [E]

20
Q

define constante catalítica

A

Kcat o número de recambio, es el número de reacciones que se producen en un centro activo por unidad de tiempo

21
Q

efecto de la [S]

A

la [S] es proporcional a las velocidades iniciales hasta que se produce la saturación de la enzima, donde se alcanza la velocidad máxima
para calcular la Km y la Vmáx se usan métodos de linealización

22
Q

a cuanto equivale 1 kat

A

1 kat = 1 mol de sustrato convertido en producto en 1 s

23
Q

zimograma

A
  • detección de proteasas en medio sólido
  • gel de caseína + proteasas
  1. Electroforesis a 4Cº
  2. Incubación a 37ºC + tinción de caseína

Halo de aclaramiento: hay proteasas que han degradado a la caseína y por eso no está teñido

Así podemos comparar la actividad de distintas proteasas

24
Q

actividad enzimática en placas

A
  • detección de proteasas con actividad extracelular
  • distintos cultivos bacterianos + caseína

las cepas positivas en proteasas mostrarán halos de aclaramiento

25
Q

detección de actividad lipasa

A

la lipasa se encarga de descomponer el triglicerido en ácido graso + glicerol. La rodamina al interaccionar con ácido grasos forma un compuesto fluorescente que se puede observar
si el microorganismo tiene proteasas no se ve el compuesto fluorescente

enzimología (17 decks)

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