Analyse Flashcards
(20 cards)
Hydrogen-deuterium exchange
(-> uitwisseling H-atomen met D atomen) bij NH peptidebackbone
snelheid hangt af van
- beschikbaarheid (h aan buitenkant of niet)
- sterkte waterstofbruggen = trager
- flexibele/ ongeordende regio wissel sneller
meer D opname = hogere massa -> je ziet dan waar en hoe snel de uitwisseling plaatsvindt
Dus
*Als een gebied op het antigeen minder D opneemt na binding met het antilichaam, duidt dat op binding
*je kan structuurverandering zien bij verschillende omstandigheden-> stabiliteit testen
*met biosimilar vergelijken
*hoe binding op andere plek structuur kan beivloeden
UV/VIS direct
elektron is in grondtoestand
licht valt op elektron en komt in aangeslagen toestand
-> abs gebeurt bij specifieke golflengte voor structuren bij eiwitten 280 nm
(beste te meten tussen 0,2 en 0,8 absorptie. Onder de 0,2 -> signaal in het ruis. Boven de 0,8 -> door hoge concentratie minder nauwkeurig)
lage golflengte = veel energie
hoge golflengte = weinig energie
elektron valt terug in grondtoestand en energie komt vrij in vorm van warmte
wet lambert beer
𝐴𝜆 = log (𝐼0/𝐼) = 𝜀 ∗ 𝑐 ∗ l
absorberende eenheden in eiwitten
bij 280 nm
(bij >340 meet je alleen verstrooiing)
tryptofaan
tyrosine
fenylalanine (niet bij 280 nm)
waarom spectrum en niet specfieke golflengte zichtbaar?
elektronen in molecuul kunnen in verschillende aangeslagen toestanden zitten
hierdoor verschillende trillingstoestanden en delta energie mogelijk = spectrum en niet 1 vaste toestand
parameters verstrooiings intensiteit
(gemeten abs = absorptie + lichtverstrooiing)
hydrodynamische straal
golflengte; lager = meer last verstrooiing
molaire absorptie coefficient
Deze is gerelateerd aan alle aminozuren die zich in het eiwit bevinden; Optelsom van
aantal aanwezige
aminozuren x
bijbehorende absorpties
en antilichaam heeft 2 heavy en light chains
UV/ Vis indirect
kleuring van eiwitten; hoe meer kleuring, hoe meer eiwit
gevoeliger (kleuring versterkt signaal)
minder invloed lichtverstrooiing (specifieker en hogere golflengte mogelijk)
minder variabiliteit in absorptie tussen eiwitsoorten (theoretische extinctiecoef niet bepalen)
nadeel is meer voorbewerking nodig en meer storing van zouten/ surfactanten etc
principe algemene eiwitkleuring
BCA-assay
eiwit + koper -> Cu2+ naar Cu+
meer eiwit = meer Cu+ = kleurloos
Cu+ met BCA geeft paarskleurig complex (en doet niks met Cu2+)
lmax = 562 nm
principe specifieke kwantificatie ELISA
erg selectief
plaat coaten met eiwit van monster
specifiek analytisch antilichaam erbij
enzymsubstraat toevoegen
enzymsubstraat wordt omgezet in complex dat kleur geeft
hoeveel antigeen aanwezig zegt meer of minder bindingen aanwezig en dus meer of minder substraatomzetting
verschillende soorten ELISA
Direct
* Voordelen: Snel + 1 analytische antilichaam nodig
* Nadelen: Lage sensitiviteit
indirect
* Voordelen: Hogere sensitiviteit + Secundaire antilichaam kan je voor meerdere testen gebruiken (anti-rat Fc met een enzyme) (algemeen antilichaam = praktisch en goedkoper)
* Nadelen: Risico op antilichaam kruisreacties + hogere noice/signal-ratio
sandwich; eerst coaten antilichaam
* Voordelen: Hoge sensitiviteit + minder noice/signal-ratio
* Nadelen: Duurt lang, hogere kosten
competititef; meer antigeen in monster = minder enzym gebonden target = minder signaal
* Voordelen: Snel, geen coating-stap nodig, handig voor kleine targets die niet makkelijk met antilichamen gebonden kunnen worden
* Nadelen: Lage specificiteit
SDS PAGE
nauwkeuriger dan SEC
niet geschikt vaststellen aggregaten
meet geen di/trimeren want niet covanlente bindingen worden verbroken door SDS
SDS: surfactant -> ontvouwt eiwit en omringt het met homogene negatieve lading
PAGE: spanningsveld trekt kleine
eiwitstructuren sneller over de gel →bandjespatroon op basis van molecuulgrootte
o Hoe kleiner het deeltje, hoe makkelijker het door een polyacrylamide gel kan gaan.
SEC (retentietijd in volume eluens want je weet flow)
scheiden obv grootte = robuust maar je kan wel zien of het aggregaten bevat
eiwit in natieve conformatie-> ontvouwing = groter molecuul = kortere retentie
Kolom gevuld met bolletjes, bolletjes hebben poriën
o Grote moleculen kunnen weinig interactie aangaan
met poriën → snel door kolom
o Kleine moleculen kunnen bolletjes diep binnendringen
door de poriën → langzaam door kolom
- Altijd ook een referentiemix scheiden
o Dan weet je de retentietijden van verschillende molecuulgroottes; Vorming ijklijnen
o Jouw onbekende molecuul kan je dan a.d.h.v. de ijklijn aflezen
o Logaritmisch ijklijn, omdat molecuulgrootte niet lineair is met retentietijd
DTT bij SDS page
reduceert S bruggen
Betere correlatie tussen Mw en migratie-afstand
* Groter molecuulgewicht met zwavelbruggen gedragen zich anders dan zonder zwavelbruggen (vouwen als chromosoom)
Subunits scheiden en Mw daarvan benaderen
* Bijv. IgG’s heavy en light chains
Stabiliteit van disulfidebruggen nagaan
* Achterkomen of er uberhaubt SS-bruggen aanwezig waren
Sommige covalente aggregaten opsporen
* SDS-page kan je niet aggregraten opsporen, want wordt ook ontvouwt met SDS-page. Met DTT kan je wel covalante aggregaten openbreken
native PAGE
zonder SDS of DTT
geen homogene lading, dus scheiding op basis van lading eiwit
bredere bandjes voor zuiver eiwit
Voor:
o Quaternaire complexen scheiden
SDS-page breekt deze structuur op
o Isovormen scheiden
Post-translationele modificaties zoals glycosylering
* Grote invloed op farmacokinetiek, farmacodynamiek, stabiliteit, en immunogeniciteit
* IgG: Suikers/N-glycanen op Fc-domein hebben echt ook effect op de werking
* Zijn groot en zeer hydrofiel
fluorescentie
meet eiwitvouwing
zelfde principe als UV met grondtoestand en lage golflengte = veel energie, hoge golflengte = weinig energie
elektron valt terug in grondtoestand= interne conversie en energie komt vrij in vorm van fluorescentie = emissie
dus 𝜆𝑒𝑚𝑖𝑠𝑠𝑖𝑒 > 𝜆𝑒𝑥𝑐𝑖𝑡𝑎𝑡𝑖e
dit verschil = stokes shift
solvent relaxation
Dipoolmoment fluorofoor wordt opgeheven door oriëntatie dipoolmomenten van watermoleculen
Na excitatie verandert het dipoolmoment van fluorofoor
Dipoolmoment geëxciteerde fluorofoor wordt opnieuw opgeheven door dipoolmomenten van watermoleculen
De heroriëntatie van watermoleculen onttrekt energie uit fluorofoor = Solvent Relaxation
Intrinsieke fluorescentie; (aminozuren in eiwitten)
o Tryptofaan (Trp/W), Tyrosine (Tyr/Y), Fenylanaline (Phe/F) hebben fluoroforen
o Selectief meten: Tryptofaan gefocust
Absorptiespectrum bij 295nm en emissiespectrum 350nm (kan verschuiven)
Bij goed gevouwen eiwit zit tryptofaan binnenin het eiwit (Tyr ook soms buiten door fenol)
dus als niet gedenatureerd dan weinig energie verloren bij relaxatie = emissie bij lage golflengte
wel gedenatureerd is dat bij een hogere golflengte
Activiteitsbepaling
enzymen:
omzetting substraat
specifieke activiteit
geen enzymen:
ELISA (bij antilichamen/ targetbinders)
Cell assays
MS
peptide bindingen breken
- B-ionen: vanaf N-terminus
- Y-ionen: vanaf C-terminus
alle fragmenten komen op het spectrum en sequentie kan worden beredeneerd -> in database zoeken wat meest overeenkomt - Meetbare invloeden met MS
o PTM’s: fosforylatie, glycosylatie; verandering in massa = meetbaar
o Degradatie: deaminatie, oxidatie, β-eliminatie; idem
o Niet meetbaar:
▪ Racemisatie → enkel conformationele verandering, massa blijft hetzelfde
▪ Aggregaatvorming → eiwitten worden gedigesteerd
