chemische / fysische instabiliteit

Question 1

liever lage pH dan hoge pH
pH max 2 lager/ hoger dan iso-elektrisch punt (liefst 1 punt afwijking)

Answer 1

meer ontledingsreacties bij hoge pH

 Als je precies op iso-elektrisch punt gaat zitten is je eiwit neutraal en dan stoten de eiwitten elkaar niet meer echt af (= meer kans op aggregatie) -> dus als je er boven of beneden zit dan stoten ze elkaar een beetje af en heb je een hogere oplosbaarheid

Question 2

consequenties ontleding voor behandeling patiënt

Answer 2

o Verlies van biologische activiteit en daarmee verminderde effectiviteit
o Immuunrespons en bijwerkingen op aggregaten/precipitaten
o Verlies van betrouwbare dosering

Question 3

chemische ontledings reacties

Answer 3

Deamidatie
Isomerisatie
Proteolyase
Recamisatie & beta eliminatie
Oxidatie
Disulfide uitwisseling

Question 4

Deamidatie

Answer 4

 Hydrolyse reactie van Aspargine (Asn) of Glutamine (Gln) zijketen
 Het verlies van een amide-groep
 Vorming Asparaginezuur (Asp) of Glutaminezuur (Glu) door carbonzuur-groep

Question 5

isomerisatie

Answer 5

 Asp zelf kan ook cyclizeren en isoAsp vormen en wederzijds d.m.v. hydrolyse en hydratatie

Question 6

Proteolyse

Answer 6

 Hydrolyse reactie van peptide-binding: de binding tussen R-CO en NH-R van 2 aminozuren
 Gebeurt niet zomaar in water, maar wel met proteolytische enzymen ((chymo)trypsine)

 Gevolgen
* Hydrolyse in zijketen -> Verandering functionaliteit
* Hydrolyse in primaire structuur -> Uiteenvallen eiwit
 Irreversibel, want carbonzuur en amide reageren niet meer samen. Eiwit wordt namelijk gevormd m.b.v. ribosomen en mRNA

Question 7

Racemisatie & β-eliminatie

Answer 7

 C-H weinig zuur-base activiteit, maar C-H van aminozuren hebben lichtelijke zure kenmerken
 Alleen bij basisch milieu met overmaat base kan reactie plaatsvinden: Deprotonatie van H+ op het α-koolstofmolecuul
 Van sp3 naar sp2 wat een vlakke structuur is
-> kan terug naar sp3 maar kan ook verder reageren:
-> racemisatie
-> β-eliminatie

 Gevolgen
* Structuurveranderingen (vlak of hoekig, functionele groepen op andere plekken) kunnen functionaliteit van eiwit beïnvloeden; verlies van biologische activiteit. Kan ook voordeel hebben; proteolytische enzymen herkennen niet meer, waardoor t1/2 verlengt wordt

Question 8

oxidatie

Answer 8

 Elk eiwit dat Histidine (His), Metionine (Met), Cysteïne (Cys), Tyrosine (Tyr) en Tryptofaan (Trp) bevat kan oxidatie ondergaan
 Oxidatie van de reactieve zijketens kunnen op elk moment gebeuren
* Metaal gekatalyseerde oxidatie; Binding van metaalion met een eiwit
o Gevoelig zijn His en Cys
* Foto-oxidatie (licht) en ‘reactive oxygen species’ (ROS)
o Gevoelig zijn Met, Tyr en Trp

Question 9

Disulfide uitwisseling

Answer 9

 Cysteïne: SH – HS d.m.v. oxidatie covalente binding; S – S (Cystine)
 Leidt tot covalente binding in hetzelfde eiwit, maar ook met andere eiwitten
* Essentieel voor eiwitvorming, maar kan ook leiden tot aggregaten

Question 10

Fysische ontleding

Answer 10

Denaturatie
Aggregatie en precipitatie
Oppervlakte adsorptie

Question 11

denaturatie

Answer 11

 =Het verlies van de tertiaire eiwitstructuur; kan zowel ir- al reversibel
* Ontvouwen van bèta-sheets en alfa-helixxen
 Veroorzaakt door een toename van temperatuur, extreme pH, organische oplosmiddel en denaturanten (urea of guanidine hydrochloride; verstoren waterstofbruggen)

Question 12

Aggregatie en precipitatie

Answer 12

 Bij ontvouwing kunnen hydrofobe zijketens van andere aminozuurketens met elkaar binden en neerslaan
normaal hydrofobe naar binnen en hydrofiel naar buiten, want energiegunstiger
* Aggregaten zijn microscopische neerslagen en dus oplosbaar
* Precipitaten zijn macroscopische neerslagen en niet oplosbaar  problemen
 Voorbeelden
* Amyloide formatie  o.a. dementie
* Insuline: Oligomeren en fibrils niet actief

Question 13

Oppervlakte adsorptie

Answer 13

 Adsorptie van eiwitten aan lichaamsvreemde omgevingen: spuiten/slangen/glas/ampullen
 Door adsorptie blijft deel achter in lichaamsvreemde omgeving
* Problemen bij bijv. bereiding en toediening

Question 14

polysorbaat 80 < CMC

Answer 14

onder de CMC concentratie, dus geen volledige verzadiging en geen goede stabiliteit

Je wilt dat de oppervlakte verzadigd is, maar niet zo ver dat je daadwerkelijk micellen krijgt -> want anders gaat je eiwit hierin zitten en ben je nog verder van huis
Dus je wilt wel minimaal de CMC bereiken, want anders is er nog ruimte voor je eiwit om aan het oppervlakte te zitten en dat wil je niet, want gaat dan niet in oplossing of kan bv gaan aggregeren (maar je wilt er ook net te ver boven zitten, want dan krijg je dus dat het in de micellen gaat zitten)

Als je geen polysorbaat hebt of te weinig betekent dat niet dat het helemaal niet oplost of gaat aggregeren -> hij wordt er alleen gevoeliger voor!

Question 15

• Preferential binding
• Preferential hydration

Answer 15

Water is heel goed voor stabiliteit, maar kan wel de binding beïnvloeden (als je meer voor de binding gaat, is het iets minder stabiel en andersom)
Vaak ga je voor een middenweg

Grote eiwitten zijn instabieler
Hoe kleiner het eiwit is, hoe stabieler het uit zichzelf is