IVb extracción y cuantificación de proteínas

Question 1

para q sirve extraer proteínas?

Answer 1

del extracto crudo de proteínas se puede purificar alguna de ellas en particular
-secuenciación (identificar gen q la codifica y poder clonarla)
-expresar una proteína recombinante silvestro o con modificacipnes especificas y estudiar función
-producir anticuerpos especificos útiles para otros estudios
-analisis estructurales
-estudiar funcion regulacion
-estudiar sus interacciones con otras moleculas

Question 2

extraccion de proteinas

Answer 2

-disrupción mecanica (de tejidos principalemente, no necesariamente si viene del cultivo)
-lisis celular
-separación de las membranas y restos celulares
-precipitación de proteinas soluble
-centrifugación
-resuspensión de proteinas

Question 3

disrupcion m
licuadora

Answer 3

la muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias

Question 4

tipo de muestra licuadora

Answer 4

gran cantidad de tejido

Question 5

d m
tubo de vidrio con piston ajustado maja las celulas por acción de corte

Answer 5

homogenizador Dounce

Question 6

tipo de muestra homogenizador dounce

Answer 6

celulas tisulares: util para protocolos de enriquecimiento de proteinas mitocondriales o nucleares

Question 7

ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las membranas celulares

Answer 7

homogenizador de ultrasonidos

tipo de muestra: células, tejidos, bacterias

Question 8

la muestra se pulveriza utilizando un mortero y una almirez refrigerados

Answer 8

pulverización en nitrogeno liquido

en tejido anima o vegetal

Question 9

d m
la ruptura celular se produce por agitación de perlas de vidrio

Answer 9

perlas de vidrio

para levaduras

Question 10

lisis celular

Answer 10

buffer de lisis con:
1. inhibidores de proteasa
2. detergente
3. algunos agentes estabilizadores

Question 11

detergente desnaturalizante

Answer 11

SDS

Question 12

detergente no desnaturalizante

Answer 12

triton x-100

*disuelve membranas pero proteinas q tengam sigan siendo funcionales

Question 13

inhibidores de proteasas

Answer 13

cocktel de diferentes inhibidores cada uno con especifidad para diferentes proteasas en particular, evitando la degradación global de las proteínas en el extracto

Question 14

precipitación y centrifugación

Answer 14

al centrifugar, en el sobrenadante se encuentran todas las proteínas solubles de la cleula y en el pellet las membranas y proteínas hidrofobicas de membrana

Question 15

para precipitar proteinas solubles en sobrenadante:

Answer 15

sulfato de amonio (NH4)2SO4 — no desnauralizante

etanol y acetona— desnaturalizantes

Question 16

cuantificacion de proteinas

Answer 16

ensayo de Bradford
es el más ampliamente utilizado

Question 17

ensayo de bradford

Answer 17

se basa en el colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida, conforme reacciona con las proteínas se torna cafe-rojizo

se realiza una curva patron con concentraciones conocidas
se lee a 595 nm}
sensibiladad 1um/ml