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biomol > Va extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos > Flashcards

Va extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards

1
Q

primer paso de la tecnología de DNA recombinante

A

aislamiento de DNA

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2
Q

DNA en eucariotas está asociado a proteínas
v o f

A

verdadero

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3
Q

son compartimentos delimitados y rodeados por membranas

A

adn en la célula eucariota

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4
Q

pasos para la extracción de ADN genómico

A
  1. muestra de células
  2. añadir buffer de lisis para mantener el pH, romper membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
  3. precipitación de proteínas
  4. precipitación ADN con alcohol frío y altas concentraciones de sal
  5. lavados
  6. resuspensión en agua libre de nucleasas
  7. cuantificación y determinación de la pureza
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5
Q

*sangre
CMSP

A

celulas mononucleares de sangre preriferica

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6
Q

q contiene el buffer de lisis?

A

-50mM Tris-HCl, pH 8.0
-1% SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)
-Proteasa. Proteinasa K (2mg/ml)

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7
Q

buffer lisis*
buffer para mantener el pH en el cual el DNA se mantiene estable y con carga negativa

A

50mM Tris-HCl, pH 8.0

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8
Q

buffer lisis*
detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación del DNA
desnaturaliza proteinas (inactivando por ej DNAsas) dejandolas accesibles para la proteasa

A

1% SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)

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9
Q

Cuando el SDS entra en contacto con la célula, captura…

A

lipidos y proteinas

*el acido nucleico permanece en solucion

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10
Q

serina proteasa activa bajo condiciones desnaturalizantes

A

proteinasa K

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10
Q

aislada del hongo Tritirachium album

A

proinasa k

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11
Q

altamente activa sobre proteinas nativas y desnaturalizadas
capaz de inactivar las RNAsas y las DNAsas

A

proteinasa K

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12
Q

destruir proteinas que crean un enlace con el DNA (ej. histonas, factores de transcripcion, polimerasas)

A

proteinasa K

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13
Q

al poner proteinasa K, q incrementa?

A

-la pureza del ADN, menor contaminación por proteínas
-la calidad/cantidad de DNA no degradado

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14
Q

ejemplo de solucion que precipita proteinas

A

soluciones de acetona

las proteínas de insolubilizan y precipitan

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15
Q

las proteinas se pueden separar por centrifugación, quedando en el precipitado (pellet), junto con los restos celulares, entonces en el sobrenadante se encuentra:

A

el acido nucleico

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16
Q

la precipitación del DNA se hace a altas concentraciones de:

A

sales (NaCl)

*los iones Na neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
*las moleculas de DNA se juntan en lugar de repelerse una a la otra
*se disminuye la solubilidad del DNA en el ambiente acuoso

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17
Q

molecula menos polar que el agua
es miscible con el agua

A

alcohol frío (etanol)

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18
Q

el DNA es soluble en etanol por lo que al agregarse a la solución de ácidos nucleicos anteriormente obtenida, el DNA precipita
v o f

A

falso

el DNA no es soluble con el etanol

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19
Q

que es más polar, el RNA o DNA

A

RNA

el RNA no precipita

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20
Q

al disminuir la temperatura el DNA se insolubiliza aún más (incubación en hielo)
v o f

A

verdadero

*las moleculas de DNA insolubilizado parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña

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21
Q

para la precipitación del DNA se hace la centrifugación a temperatura

A

fría

se obtiene una pastilla (pellet) blanco compacto en el fondo del tubo

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22
Q

cómo se realizan los lavados?

A

se lava un par de veces con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el DNA

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23
Q

cómo se resuspende el DNA

A

se solubiliza en agua libre de nucleasas (ej 25-100ul)

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24
Q

-concentracio y pureza
los espectros de absorbancia de ácidos nucleicos y proteinas (compuestos aromaticos, fenoles) muestra niveles máximos a:

A

260nm y 280nm respectivamente

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25
Q

calcula la concentración de ácidos nucleicos en la solución con base a la absorbancia a 260nm

A

espectrofotómetro

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26
Q

la pureza se determina mediante el coeficiente

A

260/280

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27
Q

valores optimos de pureza de ADN

A

1.8 - 2.0

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28
Q

valores aceptable de pureza de ADN

A

1.6 - 1.8

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29
Q

valores de contaminación con compuestos aromáticos y proteínas en la pureza de ADN

A

<1.6

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30
Q

valores donde hay contaminación con ARN en la pureza de ADN

A

> 2.1

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31
Q

Método para extracción de ARN

A

método del Fenol-Cloroformo (inicialmente en fase continua)

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32
Q

extraccion RNA*
paso 1

A

rompe membranas, desnaturaliza proteinas y libera los ácidos nucleicos de moleculas asociadas

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33
Q

extracción rna*
q hace la adición de más cloroformo?
(paso 2)

A

separa las fases

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34
Q

q es más polar, el fenol o el cloroformo?

A

fenol

cloroformo es inmiscible en agua

35
Q

extraccion rna
dónde queda el ADN ?
(paso 2)

A

el ADN menos polar que el ARN se queda entre las fases acuosa y fenólica junto con las proteínas

*el RNA permanece disuelto en la fase acuosa

36
Q

extracción de arn*
paso 3

A

se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (isopropanol) frío
el isopropanol es un alcohol menos polar q el etanol

37
Q

extracción rna*
pasos 4,5,6 y 7

A
  1. centrifugar
  2. lavar el pellet EtOH 75%
  3. resuspender RNA
  4. coeficiente 260/280
38
Q

valor aceptable en pureza del RNA

A

> 1.7

38
Q

valor óptimo en pureza del RNA

A

2.0 - 2.2

39
Q

valor con contaminación con compuestos aromaticos y proteínas en la pureza de ARN

A

<1.7

40
Q

formas de purificación de acidos nucleicos

A

-cromatografía de afinidad
-electroforesis: convencional, de campo pulsado y capilar

41
Q

tipo de cromatografía para separar ácidos nucleicos

A

de afinidad

ej. mRNA

42
Q

tipo de gel donde el
analisis principalmente de muestras de proteínas, aunque tambn para ácidos nucleicos es posible en caso de q se requiera mayor resolución que la que brinda la agarosa

A

geles de poliacrilamida

43
Q

tipo de gel
analisis de muestras de acidos nucleicos. en ________ no pueden ser observadas diferencias pequeñas (p. ej. 20pb) en pesos moleculares de las moleculas analizadas

A

geles de agarosa

-convencional
-campo pulsado

44
Q

factores intrinsecos a la partícula en movilidad electroforética

A

-relación carga/masa
-peso molecular

45
Q

factores extrínsecos a la partícula en movilidad electroforética

A

-concentración de agarosa
-voltaje aplicado
-tiempo de corrida
-temperatura

46
Q

polisacarido formado por B-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y a-(1-3)-D-galactosa
soluble en agua a teperatruras superiores a 65°
forma una matriz inerte y no tóxica

A

agarosa

47
Q

concentración de agarosa típica

A

0.5 a 4% (peso/volumen)

48
Q

la movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa
v o f

A

verdadero

49
Q

voltaje típico aplicado

A

10 V/cm de gel

geles de 10-15cm : 100V-130V

50
Q

al incrementar el voltaje la_____ aumenta

A

movilidad

*aunque no necesariamente se incrementa tambn la resolución

51
Q

voltajes para mejor resolución

A

5 V/cm de gel

voltajes menores (ej 70V)

52
Q

a menor voltaje mayor difusión lateral
v o f

A

verdadero

53
Q

a mayor tiempo de corrida, mayor:

A

resolución

precaución: que no se salga la muestra del gel

54
Q

q ocurre si se incrementa la temperatura en la electroforesis?

A

la movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa

precaución: si la temperatura se incrementa mucho se puede fundir el gel
normalmente la temperatura se mantiene lo más baja posible

55
Q

si incrementa el voltaje e incrementa el tiempo de corrida:

A

la temperatura y la movilidad aumenta

56
Q

revelado, visualizacion a n*
sustancia q se intercala entre las bases, detecta hasta 1ng de dsDNA, en la agarosa o post-corrida

A

bromuro de etidio

57
Q

a cuantos nm de UV se absorbe el bromuro de etidio

A

260-360nm
y emite fluorescencia rojo-naranja (560 nm)

58
Q

revelado. visualizacion a n*
sustancia no intercalante. alternativa menos toxica aunque menos sensible (3ng)

A

SYBR

59
Q

mezcla de moleculas (acido nucleico), de diferente peso molecular que sirve como referencia para el analisis cualitativo (determinación del peso molecular aproximado de una banda especifica) de las muestras analizadas

A

marcadores de peso molecular

60
Q

los marcadores de peso molecular pueden ser:

A

-sintéticos (ej 100pb, 1kb)
-DNA de fagos o plásmidos por ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (endonucleasas específicas de secuencias)

61
Q

analisis cualitativo*
por qué se habla de PESO MOLECULAR APARENTE?

A

pq no se puede conocer el número exacto de pb de las bandas e corrimiento de las muestras

62
Q

diferencias pequeñas (ej 20pb) en pesos moleculares entre dos bandas pueden ser distinguidas en agarosa
v o f

A

falso

NO pueden ser distinguidos en agarosa

63
Q

EMSA

A

electrophoresis mobility shift assay

64
Q

basada en la interacción entre ácidos nucleicos y proteínas

A

*EMSA
analisis de retraso en el gel

65
Q

los complejos ácidos nucleicos-proteinas tienen un peso molecular mayor por lo cual la movilidad del ácido nucleico correspondiente …

A

disminuye (se retrasa su avance en el gel)

*analisis de retraso en gel

66
Q

permite detectar interacciones entre la secuencia especifica de acido nucleico (ej TFBS) y alguna proteína funcional particular (ej factor de transcripcion)

A

*EMSA
analisis de retraso en gek

67
Q

para una mayor resolucion se emplea:

A

-voltaje menor
-mayor tiempo de corrida
-posiblemente un % mayor de agarosa

68
Q

separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de bases)
reorientación de la molécula mediante cambios periódicos en la orientación del campo eléctrico (E1 y E2)

A

electroforesis en gel de campo pulsado

69
Q

campo pulsado*
al aplicar E1 las cadenas de DNA:

A

se estiran y orientan en esa dirección

70
Q

campo pulsado*
al aplicar E2 más o menos perpendicular a E1:

A

se obliga a las cadenas de DNA a relajarse, elongarse y alinearse en una nueva dirección

71
Q

campo pulsado*
a las cadenas más cortas les toma menos tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad
v o f

A

verdadero

72
Q

campo pulsado*
cómo es la aplicación de campos eléctricos?

A

sucesiva
E1/E2/E1/E2/E1/E2…

73
Q

campo pulsado*
grados del ángulo alfa de reorientación (entre E1 y E2)

A

mayor a 100°

74
Q

campo pulsado*
para evitar q el DNA se fragmente al cargar la muestra se utilizan:

A

disoluciones concentradas de alta viscosidad o incluso células completas q lo contienen

-usualmente el DNA genomico se digiere con enzimas de restriccion previo al corrimiento electroforético

75
Q

geometria instrumentos PFGE*
campos electricos NO homogeneos:
alfa va incrementandose

A

-PFGE. pulsed field gradient electrophoresis

-OFAGE. orthogonal field-alternating gel

-TAFE. transverse alternating-field

76
Q

geometria instrumentos PFGE*
campos electricos homogeneos:

A

alfa permanece constante

-FIGE. filed inversion gel electrophoresis

-CHEF. contour-clamped homogeneous electric field

-RGE: rotating gel electrophoresis

77
Q

PFGE*
cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de DNA a separar, mayor es la duración de los pulsos aplicados y __________ el voltaje

A

menor

*la duración del pulso va desde fracciones de segundo hasta varias horas

78
Q

electroforesis con
capilares de sílice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas

A

electroforesis capilar

79
Q

electroforesis capilar tiene un campo electrico alto:

A

100-500 V/cm

80
Q

electroforesis q permite obtener resultados en corto tiempo (5-60 min) y se ocupa un minimo de muestra (nL)

A

electroforesis capilar

*muy empleada en la secuenciación automatizada

81
Q

electroforesis capilar tiene una resolución muy:

A

alta
1 nucleotido de diferencia

82
Q

cuál tiene mayor peso molecular, el DNA del gen discontinuo o el cDNA q corresponde al mRNA?

A

el DNA del gen discontinuo pq tiene intrones

el cDNA carece de intornes (menor peso molecular)

83
Q

dna genómico*
la corriente eléctrica transmite su energía a un sistema mecánico q la convierte en vibraciones de alta densidad q generan ondas de ultrasonido y vibración. en el liquido se generan millones de burbujas microscópicas, las cuales sufren rapidísimos procesos de expansión y colapso

A

lisis celular por sonicación

84
Q

dna genomico*
degradación por accion de :

A

DNAsas durante la extacción, etc

biomol (30 decks)

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