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biomol > Vd secuenciación de DNA > Flashcards

Vd secuenciación de DNA Flashcards

1
Q

fue posible en los años 1970s gracias a la introducción de los métodos electroforeticos y el conocimiento de la química de los nucleotidos y del metabolismo del DNA

A

secuenciación del DNA

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Q
A
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Q
A
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3
Q

secuenciación del DNA*
el principio general era obtener…

A

cuatro juegos de fragmentos marcados, cada uno correspondientes a cada uno de las cuatro bases

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3
Q

en un principio se empleo marca radiactiva y posteriormente la fluorescencia

A

secuenciación de DNA

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4
Q

metodo quimico

A

Maxam y Gilbert (radiactividad)

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4
Q

siguiente generación (next-gen sequencing)

A

-454- pirosecuenciación
- illumina (terminador reversible)

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4
Q

metodo enzimaticos

A

-sanger (radiactividad)
-automatizada (variaación del de Sanger-fluorescencia)

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5
Q

metodos de secuenciación de adn

A

-metodo quimico
-metodos enzimaticos
-siguiente generación (next-gen sequencing)
-secuenciación por bisulfito

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6
Q

consiste en tres etapas fundamentales:
-marcaje del DNA
-hidrolisis quimica especifica del adn
-analisis de los productos

A

metodo de Maxam y Gilbert

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6
Q

metodo maxam y gilbert*
consiste en marcar el extremo 5´de cada hebra
lo más común es usar polinucleotido CINASA y ATP radiactivo

A

marcaje del ADN

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7
Q

metodo maxam y gilbert*
para obtener fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados, de longitud variable y que terminen en un nucleotido conocido

A

hidrolisis química especifica del ADN

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8
Q

maxam y gilbert - hidrolisis*
la muestra se divide en 4 alicuotas y cada una de ellas recibe tratamiento químico dif, con el fin de:

A

eliminar separadamente las bases puricas (G y A) y pirimidicas (C y T)

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9
Q

maxam y gilbert hidrolisis*
agentes quimicos utilizados para la G

A

dimetil sulfato

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10
Q

maxam y gilbert hidrolisis*
agente químico utilizado para C,T

A

hidrazina-piperidina

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11
Q

maxam y gilbert hidrolisis*
agente químico utilizado para A, G

A

ácido fórmico-dimetilsulfato-piperidina

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12
Q

maxam y gilbert hidrolisis*
agente químico utilizado para C

A

hidrazina-1.5M NaCl-piperidina

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13
Q

maxam y gilbert*
las 4 mezclas obtenidas se analizan por electroforesis

A

análisis de los productos

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14
Q

sanger*
se emplean __________________ ademas de los normales 2´-deoxinucleotido trifosfato (dNTPs)

A

´2´,3´-dideoxinucleotidos trifosfato (ddNTPs)

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15
Q

se basa en el mecanismo normal de la replicación del DNA

A

Metodo de Sanger

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16
Q

sanger*
la DNA polimerasa extiende la cadena de DNA debiendo estar presente en el grupo:

A

hidroxilo en el carbono 3´de la desoxirribosa (la polimerización ocurre solo en la dirección 3´)

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17
Q

sanger*
los ddNTPs carecen del grupo…

A

3´hidroxilo necesario para que se lleve a cabo la polimerización

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18
Q

sanger*
fragmentos de dif longitudes se generan por interrumpción de la:

A

polimerización cada vez q un ddNTP se incorpora a la cadena decreciente

19
Q

sanger*
la polimerasa empleada deberá de carecer de la actividad 3´-5´exonucleasa de corrección
v o f

A

verdadero

20
Q

los ddNTPs están marcados con fluorescencia en lugar de radiactividad (un color dif c/u)

A

secuencia automatizada

21
Q

la reacción se lleva a cabo de uno solo tubo
la separación de los fragmentos de DNA se logra por electroforesis CAPILAR detectando en longitud de UN solo nucleotido

A

secuenciación automatizada

21
Q

secuenciación automatizada*
los fragmentos más cortos estaran igualmente hacia el…

A

5´y los más largos se encontraran en la dirección 3

22
Q

automatizada * fluorocromo
emisión: verde. derivado de fluoresencia

A

A - JOE

23
Q

automatizada * fluorocromo
emisión: azul. derivado de fluoresencia

A

C-FAM

24
Q

automatizada * fluorocromo
emisión: amarillo. derivado de rodamina

A

G-TAMRA

25
Q

automatizada * fluorocromo
emisión: rojo. derivado de rodamina

A

T-ROX

26
Q

reacción con ddNTPs marcados*
cada ddNTP está matrcado con un fluorocromo único que fluorece a una longitud de onda distinta (color), la reacción se hace en un solo:

A

tubo, ya q se puede distinguir entre ellos

27
Q

grafico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis

A

electroferograma

28
Q

se pueden compara la secuencia de una región específica (ej gen) en una persona portadora del polimorfismo/mutación q incluso puede estar sana en ese momento, con la secuencia control de una persona sana no portadora del polimorfismo/mutación asociada a la enfermedad

A

detección de un polimorfismo o mutación puntual

29
Q

una reacción de secuenciación emplea un solo primer (cebador), lo q permite obtener la:

A

secuencia de Una de las cadenas

*en un analisis posterior se puede secuenciar la otra cadena empleando el otro primer especifico

30
Q

permite secuenciar un genoma humano completo en un solo día o el de una bacteria en unas horas

A

454-pirosecuenciación

31
Q

método de secuenciación de DNA en tiempo real basado en la liberación de los pirofosfatos (PPi) q tiene lugar en la reacción de polimerización del DNA a partir de sus dNTPs

A

454-pirosecuenciación

*no se requiere correr los fragmentos en un gel, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs

32
Q

454-pirosecuenciación*
en genoma se fragmenta en cadenas de:

A

algunos cientos de pares de bases (300-800pb)

33
Q

454-pirosecuenciación*
se ligan oligonucleotidos sintéticos A y B a los extremos:

A

A. para q la secuencia se una a una micro esfera (micro reactor)

B. para la amplificación (PCR en emulsión) y secuenciación. permiten la hibridación de un primer/cebador universal

34
Q

pcr en emulsión*
cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de:

A

aceite y separada de las demas esferas

*al final aprox 2 millones de fragmentos de DNA idénticos en cada microesfera

35
Q

preparación micromatriz*
las micro esferas se depositan en una microcelda con:

A

200,000 pocillos de 44um

una sola esfera por pozo

36
Q

preparación micromatriz*
los pocillos se rellenan con:

A

esferas más pequeñas en las q se han inmovilizado enzimas para la secuenciación

37
Q

pirosecuenciación*
enzima q incorpora dNTPs liberando PPi

A

DNA polimerasa

38
Q

pirosecuenciación*
enzima para sintesis de ATP dependiente de PPi

A

sulfurilasa y su sustrato (adenosina 5´-fosfosulfato o APS)

38
Q

pirosecuenciación*
enzima para la degradación de dNTPs no incorporados

A

aspirasa

38
Q

pirosecuenciación*
enzima para la emisión de luz dependiente de ATP

A

luciferasa y su sustrato (luciferina)

39
Q

pirosecuenciación*
el sistema de flujo hace pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro nucleotidos (TACG) a traves de la:

A

placa q contiene pocillos

40
Q

pirosecuenciación*
cada vez q en uno de los pocillos se incorpora un nucleotido se genera una señal…

A

quimioluminiscente q es recogida por una cámara digital

41
Q

pirosecuenciación*
se analizan las imagenes obtenidas y se determina:

A

la secuencia del fragmento

*se reconstruye la secuencia del genoma original por métodos computacionales

42
Q

ilumina. terminador reversible*
nucleotidos terminadores marcados bloqueados reversiblemente en el:

A

3´OH

43
Q

ilumina. terminador reversible*
el bloqueo se retira _____________________ despues de haberse incorporado un nucleotido a la cadena (polimerización) y registrado la señal fluorescente q permite identificar q base fue

A

química o fotolíticamente

44
Q

permite detectar con alta sensibilidad patrones de metilación aberrantes (cambios epigenéticos - DNA)

A

secuenciación por bisulfito

45
Q

el tratamiento con bisulfito (previo a la secuenciación) convierte a la citosina en:

A

uracilo pero no afecta a la 5-metilcitosina

46
Q

bisulfito*
falsos positivos

A

en el RNA y muestras con conversión incompleta

47
Q

util en el analisis de muestras forenses, celulas madre, enfermedades como cancer

A

secuenciación por bisulfito

biomol (30 decks)

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