Centrifugazione Flashcards
(20 cards)
Cos’è la centrifugazione
Sistema che consente di AUMENTARE la VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE delle particelle.
Se si lascia una sospensione in condizioni di quiete le PARTICELLE INSOLUBILI all’interno della soluzione tendono a SEDIMENTARE per effetto della FORZA DI GRAVITA’.
Si può ACCELERARE la SEDIMENTAZIONE applicando un CAMPO GRAVITAZIONALE ARTIFICIALE chiamato CAMPO CENTRIFUGO attraverso la ROTAZIONE AD ALTA VELOCITA’
Centrifuga da laboratorio
Le provette contenenti la sospensione sono disposte su un carosello e nel momento in cui si avvia la centrifugazione le PROVETTE si muovono di MOTO CIRCOLARE UNIFORME: Il corpo percorre una TRAIETTORIA CIRCOLARE A VELOCITA’ COSTANTE.
Velocità tangente a traiettoria
Velocità costante, direzione e verso cambiano: verso orario o antiorario, direzione varia continuamente.
Il corpo è sottoposto ad una FORZA CENTRIPETA che produce un’ACCELERAZIONE CENTRIPETA che è diretta verso il centro. La forza centripeta impedisce al corpo animato di moto circolare uniforme di sfuggire per inerzia nella direzione del moto (direzione tangente alla traiettoria).
FORZA CENTRIFUGA: forza apparente uguale e contraria a forza centripeta, stessa direzione ma verso opposto
Campo centrifugo (G)
E’ dato dal PRODOTTO di OMEGA AL QUADRATO per R dove OMEGA rappresenta la VELOCITA’ ANGOLARE DEL ROTORE espressa in RADIANTI AL SECONDO, mentre R rappresenta la DISTANZA in CENTIMETRI della PARTICELLA dall’ASSE DI ROTAZIONE, quindi una DISTANZA RADIALE.
Quando un corpo si muove di moto circolare uniforme quindi percorre una traiettoria curvilinea, la velocità è sempre tangente alla traiettoria. Se si percorre un GIRO COMPLETO la VELOCITA’ TANGENZIALE è UGUALE allo SPAZIO PERCORSO, cioè la CIRCONFERENZA 2∏r FRATTO il TEMPO impiegato a percorrerlo (la velocità si calcola come rapporto fra spazio e tempo, metri al secondo).
La velocità angolare è definita come il rapporto tra l’angolo descritto (radiante) e il tempo impiegato a descriverlo ed è espresso in radianti al secondo. Il RADIANTE rappresenta il rapporto tra la lunghezza di un arco di circonferenza (l) e il raggio di tale circonferenza. Quindi se si vogliono esprimere i 360° sotto forma di radianti è 2∏. Quindi per un giro completo la velocità angolare è uguale a 2∏/t.
La VELOCITA’ ANGOLARE del rotore viene espressa in RIVOLUZIONI PER MINUTO (rpm). Una rivoluzione del rotore è pari a 2∏ radianti dal momento che rappresenta tutto l’angolo di 360°. Quindi la velocità angolare è uguale a 2∏ rpm/60 perché 2∏ rappresenta una rivoluzione, rpm sono le rivoluzioni per minuto e 60 sono i secondi per minuto. Si ottengono i RADIANTI AL SECONDO
Formula
Campo centrifugo relativo
Il campo centrifugo può essere anche espresso come MULTIPLO dell’ACCELERAZIONE GRAVITAZIONALE TERRESTRE.
Il campo centrifugo relativo (RCF) è dato dal RAPPORTO tra il CAMPO CENTRIFUGO (G) e l’ACCELERAZIONE GRAVITAZIONALE TERRESTRE (g). L’accelerazione gravitazione terrestre è pari a 9.81 m al secondo oppure 981 cm al secondo per secondo.
Formula
Il campo centrifugo relativo che agisce sulla particella è funzione della velocità di rotazione rpm al quadrato e della distanza della particella dall’asse di rotazione
Nomogramma
Le centrifughe sono dotate di NOMOGRAMMA che permette di TRASFORMARE rpm in g.
E’ utile perché in un protocollo viene indicato di CENTRIFUGARE a un determinano NUMERO DI G e la centrifuga consente di SETTARE gli RPM.
Per questa trasformazione bisogna tenere in considerazione il RAGGIO DEL ROTORE, il riferimento di RFC e gli RPM
Separazione
La separazione di una miscela di PARTICELLE ETEROGENEE all’interno di una sospensione dipende da:
- FORZA DEL CAMPO CENTRIFUGO
- DISTANZA DELLA PARTICELLA DALL’ASSE DI ROTAZIONE
ma bisogna anche considerare
- CARATTERISTICHE FISICHE DELLA PARTICELLA (densità, forma, dimensioni)
- CARATTERISTICHE DEL MEZZO IN CUI LA PARTICELLA SI TROVA (densità e viscosità della soluzione in cui la particella è sospesa)
- TEMPO DI SEDIMENTAZIONE
Forze che agiscono su una particella
Oltre alla FORZA CENTRIFUGA che tende a spingere la PARTICELLA sul FONDO della provetta, su di essa agisce anche una FORZA DI GALLEGGIAMENTO dovuta alla SPINTA DI ARCHIMEDE per cui la particella riceve una SPINTA DAL BASSO VERSO L’ALTO pari al VOLUME DEL LIQUIDO SPOSTATO.
La FORZA DI GALLEGGIAMENTO tende ad OPPORSI alla FORZA CENTRIFUGA per cui la RISULTANTE delle FORZE è data dalla DIFFERENZA tra la FORZA CENTRIFUGA e la FORZA DI ARCHIMEDE.
Formule (densità, volume, sostituzione)
La particella è sottoposta anche ad una FORZA DI ATTRITO con il mezzo: F = v f dove v è la VELOCITA’ DI SEGMENTAZIONE della particella e f è il COEFFICIENTE DI ATTRITO (indicato sulla base della legge di Stokes ed è uguale 6∏ηrp dove η è la VISCOSITA’ del mezzo e rp è il raggio della particella. E’ direttamente proporzionale alla viscosità del mezzo e alle dimensioni della particella)
Velocità di sedimentazione
Una volta che si ha il processo di centrifugazione, la PARTICELLA comincia ad entrare nella soluzione ed ACCELERA fino a quando la FORZA DI SEDIMENTAZIONE è UGUALE alla FORZA DI ATTRITO.
La particella non accelera più ma comincia a muoversi di MOTO RETTILINEO UNIFORME per cui la VELOCITA’ della particella è COSTANTE: FASE ATTIVA DELLA CENTRIFUGAZIONE.
Formule
Essa dipende da:
- RAGGIO DELLA PARTICELLA AL QUADRATO: dimensioni particella
- DIFFERENZA TRA LA DENSITA’ DELLA PARTICELLA E LA DENSITA’ DEL MEZZO
- E’ DIRETTAMENTE PROPORZIONALE AL CAMPO CENTRIFUGO APPLICATO
- E’ INVERSAMENTE PROPORZIONALE ALLA VISCOSITA’ DEL MEZZO
Velocità della sedimentazione di una particella non sferica
Si deve considerare un COEFFICIENTE D’ATTRITO DIVERSO.
Formula
Se il COEFFICIENTE D’ATTRITO della particella NON SFERICA è MAGGIORE del COEFFICIENTE D’ATTRITO della particella SFERICA allora la VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE della particella NON SFERICA è MINORE della VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE della particella SFERICA.
Se la DENSITA’ DELLA PARTICELLA è UGUALE alla DENSITA’ DEL MEZZO allora la VELOCITA’ è ZERO quindi NON c’è SEDIMENTAZIONE: la particella non si muove dalla posizione in cui è arrivata
Coefficiente di sedimentazione (s)
Si intende VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE per UNITA’ DI CAMPO CENTRIFUGO (s)
Formula
Dipende da:
- DIMENSIONI DELLA PARTICELLA
- DENSITA’ DEL MEZZO
- INVERSAMENTE PROPORZIONALE ALLA VISCOSITA’ DEL MEZZO
COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE STANDARD: coefficiente di sedimentazione che si avrebbe in un mezzo la cui DENSITA’ e VISCOSITA’ sono PARI a quelle dell’ACQUA (w= water) a 20°C per cui s 20, w.
Il coefficiente di sedimentazione dipende dalla
- CONCENTRAZIONE DELLE PARTICELLE: all’AUMENTARE della CONCENTRAZIONE delle particelle, MAGGIORE è la DIMENSIONE delle particelle stesse e MAGGIORE sarà la DIMINUZIONE del COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE.
Un COEFFICIENTE di sedimentazione più BASSO significa che la VELOCITA’ delle particelle è INFERIORE.
All’aumentare della concentrazione diminuisce il coefficiente di sedimentazione: questo è dovuto all’interferenza che le particelle esercitano le une sulle altre nel processo di sedimentazione (interferenza > diminuzione >)
- TEMPERATURA: all’AUMENTARE della TEMPERATURA il COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE AUMENTA.
Aumentando la T la molecola comincia a denaturarsi e assume una forma più flessibile che ha un coefficiente d’attrito minore rispetto a quello della molecola non denaturata. Quando la molecola è completamente denaturata, s diminuisce repentinamente.
Siccome s dipende anche dalla massa diminuisce ma rimane maggiore di quello della molecola non denaturata perché la massa dei filamenti è minore
Per la maggior parte delle molecole biologiche il COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE è estremamente PICCOLO quindi il valore unitario di base viene indicato con 10 alla -13 S (unità Svedberg)
Componenti di una centrifuga
E’ presente un ROTORE sul quale si posizionano le PROVETTE.
Il rotore si aggancia su un ALBERO ROTANTE che viene azionato da un MOTORE ELETTRICO.
E’ importante EQUILIBRARE le PROVETTE messe all’interno del rotore poiché dal momento che le centrifughe raggiungono VELOCITA’ ELEVATE un’EQUILIBRAZIONE SBAGLIATA può provocare delle DISTORSIONI dell’ALBERO MOTORE
Tipi di centrifughe
Le centrifughe si differenziano in base alla TIPOLOGIA e alla CAPACITA’ delle PROVETTE ma anche in funzione degli rpm o g che possono raggiungere:
- CENTRIFUGHE DA BANCO
- MICROCENTRIFUGHE
- CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE che ospitano contenitori molto capienti in termini di volume
- CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA’ (25000 rpm/ 60000 g)
- ULTRACENTRIFUGHE che raggiungono velocità in rpm molto elevate. La CAMERA dove è presente il rotore è CORAZZATA e SOTTOVUOTO per minimizzare gli aumenti di temperatura che possono essere generati dall’attrito con l’aria. I ROTORI sono sostenuti da un ALBERO MOTORE FLESSIBILE (albero motore rigido può portare problemi alla centrifuga visto il numero elevato di g e se le provette non sono equilibrate)
Tipi di rotori
ROTORI AD ANGOLO FISSO: hanno ALLOGGIAMENTI per le PROVETTE disposti intorno all’ASSE DI ROTAZIONE ad un ANGOLO PREFISSATO in genere di 15/45°.
Quando le PARTICELLE SEDIMENTANO tendono a muoversi in SENSO RADIALE verso la PARETE delle e dopo scivolano verso il FONDO con la formazione del SEDIMENTO chiamato PELLET con una forma a becco di flauto.
Il cammino della particella è BREVE e la SEDIMENTAZIONE è RAPIDA
ROTORI A BRACCIO OSCILLANTE: le PROVETTE sono disposte PERPENDICOLARMENTE al SUOLO quando il ROTORE è FERMO ma durante la fase di ROTAZIONE si pongono in posizione PARALLELA rispetto al suolo.
Il percorso delle particelle è MAGGIORE e il PELLET è in forma PIATTA
I rotori ad ANGOLO FISSO hanno piccole differenze tra il RAGGIO MASSIMO e il RAGGIO MINIMO a cui una particella si può trovare rispetto all’ASSE DI ROTAZIONE.
La DISTANZA dall’ASSE DI ROTAZIONE influisce sul CAMPO CENTRIFUGO APPLICATO.
Nel caso dei rotori ad angolo fisso non si fa sentire particolarmente dal momento che la differenza tra r minimo e r massimo è ridotta, mentre questa è più importante nei rotori a braccio oscillante.
In un rotore a braccio oscillante le PARTICELLE sono sottoposte ad un CAMPO sempre più INTENSO man mano che si ALLONTANANO dall’ASSE DI ROTAZIONE
Centrifugazione differenziale
Tecnica più utilizzata per il FRAZIONAMENTO CELLULARE (si può procedere per step per ottenere la frazione desiderata).
Consiste nel CENTRIFUGARE a VELOCITA’ DIVERSE per TEMPI DIVERSI la preparazione.
Per realizzare un frazionamento cellulare si parte dal MATERIALE ottenuto dall’OMOGENEIZZAZIONE di un TESSUTO, si può iniziare con una CENTRIFUGAZIONE a BASSA VELOCITA’ per 10 MINUTI e si recupera il PELLET cioè un SEDIMENTO costituito da CELLULE INTATTE, NUCLEI, MEMBRANE PLASMATICHE e CITOSCHELETRO (particelle con s elevato).
Successivamente si può recuperare il SUPERNATANTE cioè la SOSPENSIONE sopra il pellet e si può fare una CENTRIFUGAZIONE ad una VELOCITA’ MAGGIORE (20000 g) per 20 MINUTI. Nel SEDIMENTO si possono raccogliere MITOCONDRI, LISOSOMI e PEROSSISOMI.
Si può prelevare il SUPERNATANTE e andarlo a CENTRIFUGARE ad ALTA VELOCITA’ (80000 g) per 1 ORA e nel SEDIMENTO si possono raccogliere MICROSOMI, FRAMMENTI DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO, PICCOLE VESCICOLE.
Prendendo il SUPERNATANTE e sottoponendolo ad una CENTRIFUGAZIONE ancora MAGGIORE (150000 g) per 3 ORE alla fine si ottiene un SEDIMENTO che contiene i RIBOSOMI e GROSSE MACROMOLECOLE mentre il SUPERNATANTE contiene le PROTEINE SOLUBILI
Centrifugazione in gradiente di densità
All’interno della provetta si forma un GRADIENTE DI DENSITA’ DEL MEZZO che sarà CRESCENTE DALL’ALTO VERSO IL BASSO.
Il GRADIENTE si forma dal BASSO con la SOLUZIONE PIU’ DENSA verso l’ALTO in cui la SOLUZIONE è MENO DENSA.
Le SOSTANZE per formare il GRADIENTE sono il SACCAROSIO, il GLICEROLO e il CLORURO DI CESIO.
Si può distinguere tra
- GRADIENTE DISCONTINUO: si prepara andando a STRATIFICARE FISICAMENTE UNA SULL’ALTRA le SOLUZIONI a DENSITA’ progressivamente DECRESCENTE
- GRADIENTE CONTINUO: c’è una CONTINUITA’ DI GRADIENTE DECRESCENTE dal BASSO verso l’ALTO (non ci sono linee di demarcazione netta tra la densità di una soluzione e quella successiva)
Il gradiente di densità è importante perché è uno dei parametri che influiscono sulla velocità di sedimentazione ossia la differenza tra la densità della particella e la densità del mezzo
Dispositivi per la preparazione di un gradiente
Per preparare un gradiente CONTINUO si utilizzano dei contenitori chiamati BECKER che sono COLLEGATI tra loro da una VALVOLA che se APERTA mette in COMUNICAZIONE le DUE SOLUZIONI.
C’è un BECKER B in cui viene posta la SOLUZIONE A DENSITA’ MAGGIORE mentre nell’altro BECKER A viene posta la SOLUZIONE A DENSITA’ MINORE.
A questo punto viene APERTA la VALVOLA in maniera tale che la SOLUZIONE del BECKER A progressivamente si TRASFERISCA nel BECKER B.
C’è una CUNETTA MAGNETICA che permette il MISCELAMENTO delle SOLUZIONI e successivamente il BECKER B viene COLLEGATO alla PROVETTA dove comincia a STRATIFICARSI sul FONDO la SOLUZIONE A DENSITA’ MAGGIORE e successivamente la SOLUZIONE A DENSITA’ MINORE come di forma nel BECKER B che accoglie la SOLUZIONE PROVENIENTE dal BECKER A.
Nel caso di un gradiente DISCONTINUO con una SIRINGA si vanno a STRATIFICARE MANUALMENTE SOLUZIONI A DENSITA’ DIVERSA l’una sull’altra per queto si vede nettamente la LINEA DI DEMARCAZIONE
Gradienti autoformanti
Si formano DURANTE la CENTRIFUGAZIONE.
Si utilizzano delle SOLUZIONI CONCENTRATE DI SALE AD ALTA DENSITA’ (cloruro di cesio).
Questa soluzione viene CENTRIFUGATA ad ALTA VELOCITA’ per molte ORE.
Durante la centrifugazione il SALE tende a SEDIMENTARE verso il fondo per cui bisogna protrarre la centrifugazione per un tempo sufficiente a fare in modo che il SALE rimanga DISTRIBUITO all’interno della SOLUZIONE.
Quindi nella PROVETTA si crea un GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE CRESCENTE dall’ALTO verso il BASSO.
La formazione del gradiente è SIMULTANEA al processo di sedimentazione delle particelle poiché alcune PARTICELLE tenderanno ad essere trasportate verso il FONDO se si trovano in una POSIZIONE NEL GRADIENTE dove la DENSITA’ DEL GRADIENTE è MINORE rispetto a quella della PARTICELLA, mentre se le PARTICELLE si trovano in una POSIZIONE in cui la loro DENSITA’ è MINORE rispetto quella del GRADIENTE saranno spinte verso la SUPERFICIE.
Al termine della centrifugazione c’è un GRADIENTE che si è AUTOFORMATO al cui interno si sono separate le PARTICELLE in funzione della loro DENSITA’.
Nel caso di un GRADIENTE DI DENSITA’ PREFORMATO, questo viene formato PRIMA di caricare il CAMPIONE per cui il CAMPIONE sarà STRATIFICATO sulla SUPERFICIE DEL GRADIENTE.
Si avvia la centrifugazione e il CAMPIONE comincia a penetrare nel MEZZO.
Le particelle si SEPARANO in base alla DENSITA’ quindi quelle a DENSITA’ MAGGIORE si muoveranno verso il FONDO mentre quelle a DENSITA’ MINORE rimarranno in POSIZIONE INTERMEDIA
Centrifugazione zonale di velocità
Consente di SEPARARE PARTICELLE che hanno DENSITA’ SIMILE ma DIMENSIONI DIFFERENTI.
Si realizza una CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE e si recupera un sedimento che contiene MITOCONDRI, LISOSOMI e PEROSSISOMI che si vogliono SEPARARE sfruttando le loro DENSITA’ che sono molto SIMILI.
Si deve preparare un GRADIENTE DI DENSITA’ la cui DENSITA’ MASSIMA e MINIMA NON devono DIFFERIRE di molto dalla DENSITA’ delle PARTICELLE che si vogliono separare.
Nell’equazione della velocità la differenza tra densità si deve al numeratore della frazione.
Dal momento che si vogliono separare le particelle in funzione delle DIMENSIONI bisogna fare in modo che la DIFFERENZA tra DENSITA’ sia ridotta al MINIMO in maniera tale che la VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE venga a dipendere dalle DIMENSIONI delle particelle.
E’ importante che la centrifugazione duri un tempo definito tale per cui le particelle che si intendono separare vadano a formare delle BANDE BEN DEFINITE e SEPARATE le une dalle altre, ma il PROCESSO deve essere ARRESTATO PRIMA che tutte le PARTICELLE arrivino a SEDIMENTARE sul fondo
Centrifugazione isopicnica (equilibrio di densità)
Consente di SEPARARE PARTICELLE che hanno DENSITA’ DIVERSA ma DIMENSIONI SIMILI.
La DENSITA’ MASSIMA e MINIMA del GRADIENTE devono DIFFERIRE abbastanza da quella delle PARTICELLE che si vogliono separare.
La PARTICELLA si FERMA (v=0) quando raggiunge nella provetta la ZONA DI DENSITA’ del GRADIENTE che corrisponde alla PROPRIA DENSITA’.
La centrifugazione isopicnica è indipendente dal tempo di centrifugazione ossia si può portare avanti il processo per ore ma nel momento in cui la PARTICELLA ha raggiunto la POSIZIONE de gradiente in cui la propria DENSITA’ EGUAGLIA quella del MEZZO la PARTICELLA NON si MUOVE più perché la velocità è zero.
Il RECUPERO del MATERIALE SEPARATO viene realizzato facendo un FORO sul FONDO della provetta e raccogliendo FRAZIONI di un determinato VOLUME che verranno analizzate e verranno recuperate quelle che contengono il materiale che interessa
Provette
Quelle più comunemente utilizzate sono PROVETTE IN POLIPROPILENE di tipo FALCON da 50 o 15 ml che NON sopportano CENTRIFUGAZIONI ad ELEVATI rpm o NUMERO di g.
Ci sono provette in POLIETILENE o POLIPROPILENE, provette in POLICARBONATO, provette in POLISULFONE.
Alcune risultano essere OPACHE altre TRASPARENTI.
Quando si lavora in STERILITA’ si utilizzano PROVETTE che possono essere AUTOCLAVATE che possono essere provette di TEFLON o di POLICARBONATO.
Ci sono provette in VETRO e provette in COREX che sono di VETRO ma molto più RESISTENTI del vetro normale
