Dosaggio di proteine Flashcards
(21 cards)
A cosa serve il dosaggio di proteine
Determinare la CONCENTRAZIONE di CAMPIONI PROTEICI
Assorbanza a 280 nm
Una tecnica semplice ma non accurata è MISURARE l’ASSORBANZA del campione proteico a 280 nm (massimo dovuto alla presenza di aa aromatici).
Si stima che se una SOLUZIONE PROTEICA ha un ASSORBIMENTO pari a 1 (1 densità ottica), la sua CONCENTRAZIONE corrisponde a 1 mg/ml.
E’ un sistema rapido e non distruttivo perché si può recuperare il campione e riutilizzarlo.
Ha un LIMITE DI SENSIBILITA’ di 10 µg/ml per cui per concentrazioni da 10 µg/ml in su la determinazione è ACCURATA.
Al di SOTTO di questa concentrazione la determinazione è MENO ACCURATA, ma si può AUMENTARE il LIMITE DI SENSIBILITA’ andando a leggere l’ASSORBIMENTO a 220 nm (legami peptidici)
Svantaggi
APPROSSIMAZIONE: l’ASSORBIMENTO delle proteine dipende dalla COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA quindi a parità di CONCENTRAZIONE PROTEICA tra DUE SOLUZIONI, si avrà un MAGGIORE ASSORBIMENTO della soluzione che contiene PIU’ AA AROMATICI
INTERFERENZA: da parte degli ACIDI NUCLEICI che hanno un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 260 nm ma continuano ad ASSORBIRE anche a 280 nm (acidi nucleici contribuiscono al valore di assorbimento)
Strategie per determinare buona qualità della soluzione proteica
- Leggere il VALORE DI ASSORBIMENTO a 280 nm e a 260 nm poi fare il RAPPORTO fra i due. Se il RAPPORTO è MAGGIORE di 2 quindi c’è un ASSORBIMENTO DOPPIO o PIU’ a 280 nm si può dire che la SOLUZIONE PROTEICA NON è CONTAMINATA da ACIDI NUCLEICI
- CORREGGERE secondo FATTORI DI CORREZIONE per il CONTENUTO degli ACIDI NUCLEICI ossia la CONCENTRAZIONE DELLA PROTEINA può essere stimata moltiplicando l’ASSORBIMENTO a 280 nm PER 1.55 e SOTTRAENDOLO al PRODOTTO dell’ASSORBIMENTO a 260 nm PER 0.76
Applicazione della legge di Lambert-Beer
Se in una soluzione si conosce una PROTEINA PURA e si conosce il suo ε MOLARE si può determinare la sua CONCENTRAZIONE andando a leggere l’ASSORBIMENTO della soluzione e facendo poi il RAPPORTO tra A e ε.
Qualora NON si conosca l’ε, questo si può CALCOLARE conoscendo la STRUTTURA PRIMARIA quindi la SEQUENZA AMMINOACIDICA o la sua COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA (aa aromatici).
Si può MOLTIPLICARE il TIPO di AA AROMATICO per il suo ε MOLARE e facendo la SOMMA:
n Trp x 5600 + n Tyr x 1420 + n Cys x 300 = ε proteina
Non si tiene conto della Phe perché il suo ε è basso e perché il suo contributo a 280 nm è molto basso
Metodo del rapporto
Quando non si conosce l’ε molare e non si può calcolare.
La CONCENTRAZIONE del CAMPIONE PROTEICO viene messa in relazione con la CONCENTRAZIONE del CAMPIONE PROTEICO a CONCENTRAZIONE NOTA.
Si mettono in relazione le ASSORBANZE dei DIE CAMPIONI PROTEICI e si attribuisce alla SOLUZIONE PROTEICA a CONCENTRAZIONE IGNOTA lo STESSO ε di quella a CONCENTRAZIONE NOTA.
Applicando ad applicare il metodo del rapporto si possono SEMPLIFICARE gli ε e le l:
ci= Ai x cn/ An
Metodi colorimetrici
La SOLUZIONE viene fatta REAGIRE con un REAGENTE che dà luogo ad un PRODOTTO COLORATO per cui si possono realizzare le letture nell’ambito del VISIBILE.
Inoltre questi metodi permettono di AUMENTARE la SENSIBILITA’ del SISTEMA perché il COMPLESSO PROTEINA-COLORANTE ha un ε MOLARE ELEVATO che permette un ASSORBIMENTO ELEVATO anche se la CONCENTRAZIONE è BASSA
Metodo di Bradford
Si basa sull’utilizzo del COLORANTE COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250 che è caratterizzato dalla presenza di GRUPPI SOLFONICI CARICHI NEGATIVAMENTE e GRUPPI AMMINICI.
Il COLORANTE è presente in FORMA ANIONICA con CARICA -1 (2 negative e 1 positiva), ma può essere anche in FORMA CATIONICA con CARICA +1 (3 positive e 2 negative).
Quando il COLORANTE viene COMPLESSATO alle PROTEINE la FORMA che interagisce è quella ANIONICA tramite FORZE DI VAN DER WAALS con gli aa aromatici grazie ai gruppi idrofobici e INTERAZIONI IDROSTATICHE tra i gruppi amminici e i gruppi solforici.
Il COMPLESSO COOMASSIE-PROTEINA sviluppa un colore BLUASTRO con un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 595 nm.
Quando il colorante NON è COMPLESSATO con le proteine si trova in FORMA CATIONICA (+1) e sviluppa un colore ROSSO-MARRONE con un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 465 nm.
Questo metodo consente di determinare CONCENTRAZIONI PROTEICHE comprese nell’intervallo 1-20 µg/ml.
Visto che l’ε molare del cromoforo non è nota, si può costruire una RETTA DI TARATURA con una PROTEINA STANDARD cioè a una CONCENTRAZIONE NOTA dalla quale si può determinare la CONCENTRAZIONE del CAMPIONE.
Proteina standard: albumina di siero bovino (BSA)
- facilmente reperibile in commercio
- non costosa
- ε percentuale a 280 nm noto: 6.06
Si può calcolare in maniera accurata la concentrazione c=A/ε
Retta di taratura
Si costruisce per approssimare al meglio la CONCENTRAZIONE VERA della SOLUZIONE.
Si utilizzano diverse soluzioni a CONCENTRAZIONA NOTA che contengono differenti quantità di proteina.
Si misurano i VALORI DI ASSORBIMENTO di queste soluzioni e si pongono in un GRAFICO in funzione della CONCENTRAZIONE. Si ottengono dei PUNTI che vengono ALLINEATI per formare la RETTA DI TARATURA che viene utilizzata per determinare la CONCENTRAZIONE del CAMPIONE INCOGNITO.
Si prepara una SOLUZIONE del CAMPIONE INCOGNITO, si legge l’ASSORBIMENTO (Ax) e sfruttando la RETTA DI TARATURA si determina la sua CONCENTRAZIONE
Procedura per la costruzione della retta di taratura
- Bisogna preparare ALMENO 3 SOLUZIONI di PROTEINA STANDARD A CONCENTRAZIONE NOTA DIVERSA (essenziale per tracciare la miglior retta passante per i punti)
- Si prende una QUANTITA’ DI PROTEINA STANDARD pari a es. 1, 3 e 6 µg in un VOLUME FINALE di 1 ml
- Si parte da una SOLUZIONE DI PROTEINA a CONCENTRAZIONE NOTA pari a 0.2 mg/ml che si può esprimere come 0.2 µg/µl
- Si devono calcolare quanti µl di BSA a CONCENTRAZIONE= 0.2 µg/µl si devono pipettare per PRELEVARE 1 µg, 3 µg e 6 µg di PROTEINA STANDARD
- Si fa PROPORZIONE
0.2 µg : 1 µl = 1 µg : x µl x= 5 µl BSA
0.2 µg : 1 µl = 3 µg : x µl x= 15 µl BSA
0.2 µg : 1 µl = 6 µg : x µl x= 30 µl BSA - Nel campione si mette una QUANTITA’ DI COOMASSIE COSTANTE ossia 200 µl su 1000 µL (1 ml) di VOLUME FINALE
- Per arrivare a 1 ml si aggiunge ACQUA:
5 µl BSA + 200 µl COOMASSIE + 795 µl ACQUA
15 µl BSA + 200 µl COOMASSIE + 785 µl ACQUA
30 µl BSA + 200 µl COOMASSIE + 770 µl ACQUA - PROVETTA con il BIANCO: soluzione di riferimento in cui è stata solubilizzata la proteina a meno della proteina. Costituita da 800 µl ACQUA + 200 µl COOMASSIE
- Si mettono DUE CUVETTE con il bianco nello spettrofotometro a DOPPIO RAGGIO, si fa l’AZZERAMENTO a 595 nm poi si SOSTITUISCE una CUVETTA con quella in cui c’è il CAMPIONE
- Si misura l’ASSORBIMENTO a 595 nm dei campioni e si segnano i valori: 0.06, 0.2 e 0.32 che sono proporzionali alla concentrazione
- Contemporaneamente si prepara il CAMPIONE INCOGNITO
- Bisogna verificare che i CAMPIONI di PROTEINA STANDARD evidenzino la GRADAZIONE DI COLORE BLU progressivamente CRESCENTE
- Si preparano DUE ALIQUOTE del CAMPIONE INCOGNITO una il doppio dell’altra nello stesso modo della proteina standard (1 ml = V finale, 200 µl = coomassie)
10 µl + 790 µl ACQUA + 200 µl COOMASSIE
20 µl + 780 µl ACQUA + 200 µl COOMASSIE - Bisogna verificare che il COLORE del CAMPIONE INCOGNITO sia INTERMEDIO rispetto ai PUNTI DI COLORI nella retta di taratura: colore lontano dal blu significa poco concentrato (utilizzare 100 µl invece di 10 µl), colore troppo intenso significa che va diluito (diluizione 1:100 o 1:50)
- Se il COLORE è INTERMEDIO si fa la LETTURA allo spettrofotometro dell’ASSORBIMENTO a 595 nm dei CAMPIONI INCOGNITI e si ottengono i valori 0.13 e 0.28 ossia dei valori uno il doppio rispetto all’altro come ci si aspettava
- Con i VALORI DI ASSORBIMENTO ottenuti si costruisce la RETTA DI TARATURA
Grafico: sulle ascisse µg da 1 a 6 e sulle ordinate assorbimento.
Posti sul grafico i valori di assorbimento e i µg/ml, si mettono in relazione individuando i punti e si estrapola la MIGLIOR RETTA passante per quei punti. Si utilizza questa retta per determinare la CONCENTRAZIONE del CAMPIONE INCOGNITO.
Si inseriscono nel grafico i VALORI DI ASSORBIMENTO dei CAMPIONI INCOGNITI e si tracciano le DIRETTRICI, sull’ASSE delle ASCISSE individuando i VALORI in µg/ml relativi (2.2 µg/10 µl e 4.3 µg/20 µl) - Si calcola la CONCENTRAZIONE PROTEICA in mg/ml o µg/µl dividendo 2.2/10 e 4.3/20
- Ottenuti i VALORI si calcola il VALORE MEDIO che approssima la CONCENTRAZIONE REALE del campione (0.21)
- Si calcola la CONCENTRAZIONE utilizzando excel che calcola l’EQUAZIONE DELLA RETTA (y= ax + b) e da questa si calcola. Poi si fa la MEDIA
Vantaggi e svantaggi
VANTAGGI: è un metodo semplice, ha un’elevata sensibilità (1-10 µg/ml), il complesso proteina-coomassie è abbastanza stabile, sistema pratico e accurato
SVANTAGGI: dopo l’utilizzo bisogna eliminare le cuvette (cuvette in plastica o usa e getta) perché il reagente le colora, la quantità di colorante che interagisce con le proteine dipende dal contenuto di aa aromatici e basici (scegliere standard opportuno)
Metodo del biureto
Se si RISCALDA l’UREA a 180°C si ha la formazione del BIURETO che deriva dalla CONDENSAZIONE di DUE MOLECOLE di UREA e l’ELIMINAZIONE di una MOLECOLA di AMMONIACA.
Se il BIURETO viene posto in una SOLUZIONE ALCALINA contenente IONI RAMEICI (no +2) si forma un COMPLESSO DI COORDINAZIONE di colore VIOLETTO.
Questa reazione NON è SPECIFICA per il BIURETO ma gli IONI RAMEICI in ambiente alcalino reagiscono con qualsiasi COMPOSTO che contenga DUE O PIU’ GRUPPI AMMINICI o AMMIDICI.
Per cui questa reazione può avvenire a partire dai tripeptidi.
Il REATTIVO del BIURETO è costituito da una SOLUZIONE DI SOLFATO DI RAME ALCALINO contenente TARTARO DI SODIO e POTASSIO che EVITA la PRECIPITAZIONE del RAME IN ECCESSO sotto forma di IDROSSIDO.
In condizioni ALCALINE gli IONI RAMEICI vanno a formare un COMPLESSO DI COORDINAZIONE con 4 GRUPPI NH presenti nei LEGAMI PEPTIDICI.
Si forma quindi un LEGAME DI COORDINAZIONE chiamato anche LEGAME DATIVO tramite il LONE PAIR degli ATOMI DI AZOTO.
Questo ECCESSO di CARICA NEGATIVA intorno agli IONI RAMEICI porta ad una RIDUZIONE del RAME RAMEICO 2+ a RAMEOSO +.
La reazione determina una VARIAZIONE del COLORE da blu a VIOLETTO la cui INTENSITA’ è PROPORZIONALE alla CONCENTRAZIONE DELLA PROTEINA in soluzione.
L’ASSORBIMENTO va letto a 550 nm
Vantaggi e svantaggi
VANTAGGI: si basa sull’interazione degli ioni rameici con i legami peptidici (tutta la catena polipeptidica reagisce, coomassie reagisce con aa aromatici e basici)
SVANTAGGI: c’è una scarsa sensibilità poiché il metodo non è adatto a misurare concentrazioni inferiori a 1 mg/ml (concentrazione elevata). Ci può essere un’interferenza da parte di sali ammonici perché la presenza di gruppi amminici può interferire con la formazione del complesso di coordinazione
Metodo di Lowry
Consiste nella REAZIONE DEL BIURETO seguita dalla RIDUZIONE in condizioni alcaline di un REATTIVO chiamato REATTIVO DI FOLIN-CIOCALTEU che è costituito da ACIDO FOSFOTUNGSTICO e ACIDO FOSFOMOLIBDICO.
Si ha la formazione di un CROMOFORO di colore SCURO tendente al BLU in presenza della proteina.
L’ASSORBIMENTO va letto a 750 nm.
Questo reattivo viene utilizzato per la determinazione della CONCENTRAZIONE dei COMPOSTI FENOLICI e POLIFENOLICI perché determina l’OSSIDAZIONE dei COMPOSTI FENOLICI e la RIDUZIONE del REATTIVO con lo sviluppo di un CROMOFORO.
In condizioni BASICHE il C AROMATICO legato all’OH FENOLICO (no +1) si OSSIDA in presenza del REATTIVO DI FOLIN a CARBONILE (no +2) determinando la RIDUZIONE del REATTIVO DI FOLIN con formazione di BLU DI TUNGSTENO e BLU DI MOLIBDENO.
Per determinare la CONCENTRAZIONE delle PROTEINE si può far REAGIRE il REATTIVO DI FOLIN con la TIROSINA che ha una catena laterale FENOLICA.
Si fa prima reagire la SOLUZIONE PROTEICA con gli IONI RAMEICI in ambiente basico (reazione del biureto).
Gli ioni rameici vengono complessati dai gruppi NH dei legami peptidici e poi RIDOTTI a RAMEOSI.
Si AGGIUNGE il REATTIVO DI FOLIN che determina una OSSIDAZIONE dello IONE RAMEOSO con RIDUZIONE del REATTIVO DI FOLIN.
SI formano così i CROMOFORI che hanno un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 750 nm
Vantaggi e svantaggi
VANTAGGI: poco costoso, di facile esecuzione, altamente riproducibile, aumenta la sensibilità fino a 10 µg/ml
SVANTAGGI: ci possono essere interferenze con sostanze come Tris, HEPES e EDTA
Metodo BCA
Nella reazione dell’ACIDO BICINCONICO si ha una prima parte del metodo che corrisponde a quella del BIURETO ossia si fa reagire la proteina con ioni rameici e poi si fa interagire il COMPLESSO con l’ACIDO BICINCONICO.
Gli ioni rameici vengono ridotti a RAMEOSI. Lo ione RAMEOSO viene CHELATO da DUE MOLECOLE di ACIDO BICINCONICO portando alla formazione di un CROMOFORO che ha un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 562 nm.
L’INTENSITA’ del COLORE è PROPORZIONALE alla quantità di PROTEINA
Vantaggi e svantaggi
VANTAGGI: ha una sensibilità molto elevata (10 µg/ml), ha una ridotta sensibilità alla presenza di detergenti (se fossero presenti nella soluzione)
SVANTAGGI: ci possono essere interferenze con altre sostanze
2-D quant kit
Metodo utilizzato per QUANTIFICARE degli ESTRATTI PROTEICI TOTALI dalle CELLULE o TESSUTI impiegati nelle analisi proteomiche.
E’ un KIT DI QUANTIFICAZIONE utilizzato per CAMPIONI che devono essere sottoposti a ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE che è un sistema di SEPARAZIONE DI PROTEINE di un campione utilizzato per le ANALISI PROTEOMICHE (si studiano proteine presenti in un campione di interesse)
Estrazione delle proteine
Viene realizzata con SOLVENTI che consentono la PRECIPITAZIONE di TUTTE le PROTEINE del campione. Questo consente di RECUPERARE IN TOTO.
Per riportare in SOLUZIONE le PROTEINE PRECIPITATE bisogna utilizzare degli AGENTI CAOTROPICI o dei DETERGENTI che consentono alle PROTEINE di ritrovare una CONFORMAZIONE che possa renderle SOLUBILI.
Questi agenti sono INCOMPATIBILI con i metodi di DETERMINAZIONE della CONCENTRAZIONE.
Le PROTEINE che sono state SOLUBILIZZATE in presenza di SOSTANZE INCOMPATIBILI con altri REATTIVI vengono MISCELATE ad una SOLUZIONE di un PRECIPANTE e un COPRECIPITANTE che determinano la PRECIPITAZIONE di TUTTE le PROTEINE del campione
Raccolta proteine precipitate
Le proteine precipitate vengono raccolte tramite CENTRIFUGAZIONE e RISOSPESE in una soluzione alcalina contenente IONI RAMEICI.
Gli IONI RAMEICI interagiscono con i LEGAMI PEPTIDICI delle proteine.
Si aggiunge un AGENTE COLORIMETRICO che reagisce con gli IONI RAMEICI LIBERI in soluzione.
Si sviluppa un CROMOFORO la cui INTENSITA’ è INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla CONCENTRAZIONE della proteina
Curva standard
Quando si costruisce la curva standard, questa avrà una PENDENZA INVERTITA quindi un COEFFICIENTE ANGOLARE NEGATIVO dal momento che MAGGIORE è la CONCENTRAZIONE della PROTEINA MINORE è l’ASSORBIMENTO della soluzione perché è MINORE il numero di IONI RAMEICI LIBERI che permettono lo sviluppo del CROMOFORO.
A BASSE CONCENTRAZIONI di proteina corrisponde un ASSORBIMENTO MAGGIORE.
Sistema compatibile con concentrazioni elevate di sostanze (detergenti, specifici tamponi, agenti caotropici denaturanti) che sono incompatibili con altri metodi di determinazione di concentrazione proteica
