Informazioni sull'accessibilità dei residui ionizzabili Flashcards
(5 cards)
Utilizzo delle tecniche spettroscopiche
Vengono utilizzate per ottenere INFORMAZIONI sulla STRUTTURA TRIDIMENSIONALE delle proteine o per VALIDARE dei MODELLI DI STRUTTURA TRIDIMENSIONALE ottenuti tramite programmi computerizzati
Ionizzabilità
La ionizzabilità di alcuni RESIDUI delle proteine è dovuta alle CATENE LATERALI che possono essere CARICHE POSITIVAMENTE (aa basici) o NEGATIVAMENTE (aa acidi), ma ci sono anche CATENE LATERALI NON CARICHE a pH FISIOLOGICO che possono subire una IONIZZAZIONE se il pH viene VARIATO
Proprietà di ionizzazione della tirosina
La Tyr in condizioni di pH FISIOLOGICO ha un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 274 nm, a pH BASICO (pH 13) si ottiene la IONIZZAZIONE dell’OH LEGATO al BENZENE e il MASSIMO DI ASSORBIMENTO è a 295 nm.
Questo è dovuto ad una DIFFERENTE DELOCALIZZAZIONE ELETTRONICA nel GRUPPO FENOLICO DISSOCIATO che porta la TIROSINA ad ASSORBIRE LUNGHEZZE D’ONDA MAGGIORE (E minore).
Si possono sfruttare le PROPRIETA’ DI ASSORBIMENTO della tirosina in forma INDISSOCIATA e DISSOCIATA per capire la loro POSIZIONE nella STRUTTURA TRIDIMENSIONALE delle proteine e quindi se si trovano sulla SUPERFICIE della proteina o all’INTERNO
Grafico 1
Proteina ipotetica con 5 tirosine, si fa un’analisi spettrofotometrica per ottenere informazioni sulla localizzazione dei residui amminoacidici
n° Tyr: calcolato in base all’assorbimento in funzione del pH, ε 2500 M alla -1 x cm alla -1 a 295 nm
Capire se l’assorbimento è relativo alla ionizzazione di 1, 2, 3 o 5 Tyr
Si parte da un pH FISIOLOGICO intorno a 6-7 e si AUMENTA portandolo a valori di 12-13 quindi FORTEMENTE BASICO.
Il pka della tirosina è intorno a 9.8 quindi quando il pH=pka, la CONCENTRAZIONE della forma DISSOCIATA e la CONCENTRAZIONE della forma INDISSOCIATA sono EQUIMOLARI o EQUINORMALI.
CURVA A: AUMENTANDO il pH da 6 a 8-8.5 l’ASSORBIMENTO NON VARIA perché mantiene la sua FORMA INDISSOCIATA.
Avvicinandosi al pka della CATENA LATERALE della tirosina si vede un REPENTINO AUMENTO dell’ASSORBIMENTO che arriva ad un VALORE tale per cui si può ipotizzare che le 5 TIROSINE si IONIZZANO TUTTE CONTEMPORANEAMENTE e quindi si può desumere che le 5 TIROSINE sono TUTTE ESPOSTE AL SOLVENTE
CURVA B: in corrispondenza del pka della tirosina si ha un AUMENTO di ASSORBIMENTO che è compatibile con la IONIZZAZIONE di 2 RESIDUI di Tyr quindi sono ESPOSTI AL SOLVENTE.
Aumentando il pH da 10 fino a quasi 12 non si determina una variazione dello stato di ionizzazione dei residui (non sono facilmente raggiungibili dal solvente).
Intorno a pH 12 si ha un REPENTINO AUMENTO dell’ASSORBIMENTO fino ad arrivare ad un VALORE corrispondente a quello della IONIZZAZIONE di 5 Tyr.
A circa pH 12 la PROTEINA si è DENATURATA e anche le 3 Tyr all’interno del CORE IDROFOBICO ora sono ESPOSTE AL SOLVENTE e possono essere IONIZZATE
CURVA C: nel primo tratto si sovrappone alla CURVA B quindi 2 Tyr sono ESPOSTE AL SOLVENTE.
AUMENTANDO il pH da 10 a 12 si ha un AUMENTO GRADUALE dell’ASSORBIMENTO quindi si può ipotizzare che le 3 Tyr si trovino in una REGIONE della proteina facilmente ACCESSIBILE al SOLVENTE quindi con una piccola denaturazione il SOLVENTE può RAGGIUNGERE le TIROSINE e IONIZZARLE
Grafico 2
Situazione reale relativa alla RIBONUCLEASI PANCREATICA BOVINA (proteina con 6 Tyr).
Si parte da un pH vicino alla NEUTRALITA’ e ci sposta verso un pH BASICO.
Intorno a pH 10 si inizia ad avere un AUMENTO dell’ASSORBIMENTO della PROTEINA che arriva intorno all’assorbimento relativo alla IONIZZAZIONE di più o meno 3 RESIDUI di Tyr. Quindi questi si trovano esposti al solvente sulla SUPERFICIE ESTERNA della proteina.
La PROTEINA mantiene la propria CONFORMAZIONE NATIVA e si riesce a determinare la IONIZZAZIONE di 3 residui di Tyr. Il fatto che la proteina proteina mantenga la conformazione si può verificare con un processo di RETROTITOLAZIONE cioè si riporta il pH al VALORE DI PARTENZA e si nota che si hanno dei VALORI DI ASSORBIMENTO IDENTICI a quelli avuti AUMENTANDO il pH. Quindi si mantiene la CONFORMAZIONE TRIDIMENSIONALE della proteina dal momento che il CROMOFORO è IDENTICO nelle fasi di aumento e diminuzione del pH.
AUMENTANDO il pH si ha un AUMENTO dell’ASSORBIMENTO fino a pH 13 in cui si ha un ASSORBIMENTO corrispondente alla TITOLAZIONE di tutte e 6 le TIROSINE. Quindi da pH 11 a pH 14 la PROTEINA si è DENATURATA e le Tyr sono state ESPOSTE AL SOLVENTE e si sono IONIZZATE.
E’ stato indispensabile denaturare la proteina perché si cominci ad avere un repentino aumento dell’assorbimento a pH 12.
Con la RETROTITOLAZIONE a partire da pH 12 si ottiene una CURVA DIVERSA da quella della fase di aumento perché avendo DENATURATO completamente la PROTEINA questa non riassume la conformazione nativa ma trova una NUOVA CONFORMAZIONE ossia un CROMOFORO DIVERSO per cui i VALORI DI ASSORBIMENTO seguono un ANDAMENTO DIVERSO rispetto a quello della fase di aumento
