Fluorimetria Flashcards
(10 cards)
Che cos’è la fluorimetria?
E’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della FLUORESCENZA.
La materia è in grado di assorbire la luce a determinate lunghezze d’onda che sono correlate a quella quantità di energia necessaria a consentire agli elettroni di passare da un livello energetico fondamentale ad un livello energetico eccitato.
Gli elettroni tendono a tornare allo stato fondamentale e cedono il loro eccesso di energia sotto forma di energia termica e la lunghezza d’onda di eccitazione corrisponde alla lunghezza d’onda di emissione.
Ci sono MOLECOLE che sono in grado di tornare allo STATO FONDAMENTALE cedendo l’ECCESSO DI ENERGIA come RADIAZIONI LUMINOSE, quindi viene persa in parte come energia termica e in parte viene emessa sotto forma di energia luminosa.
L’EMISSIONE di RADIAZIONI FLUORESCENTI avviene a LUNGHEZZE D’ONDA MAGGIORI rispetto alla RADIAZIONE ASSORBITA perché nel ritorno dell’elettrone allo STATO FONDAMENTALE una parte dell’energia viene persa sotto forma di ENERGIA TERMICA e solo da un livello di energia in poi viene persa sotto forma di RADIAZIONE LUMINOSA.
L’ENERGIA associata a questa radiazione luminosa risulterà essere MINORE rispetto all’energia della radiazione assorbita quindi la LUNGHEZZA D’ONDA è MAGGIORE
Molecole in grado di fluorescere
Alcune molecole che hanno CARATTERISTICHE STRUTTURALI PARTICOLARI sono in grado di FLUORESCERE.
Per esempio, trans-stilbene e cis-stilbene sono la STESSA MOLECOLA solo con LEGAMI in TRANS e CIS ma solo quella TRANS è in grado di FLUORESCERE.
Basta una DIFFERENTE CONFORMAZIONE della molecola per farle acquisire una PROPRIETA’ in più.
Le strutture della FLUORESCEINA e della FENOLFTALEINA sono molto SIMILI: la FLUORESCEINA ha un LEGAME IN PIU’ ma è una CONFIGURAZIONE e una DISPOSIZIONE ELETTRONICA che consente alla MOLECOLA di essere FLUORESCENTE mentre la fenolftaleina non lo è
Emissione di fluorescenza
Avviene sempre a partire dal LIVELLO E1 verso il LIVELLO E0.
Anche se un elettrone viene eccitato al secondo o al terzo livello cede comunque la sua energia sotto forma di calore.
L’emissione di FLUORESCENZA delle molecole che si trovano nello stato E1 è legata all’emissione di vari FOTONI DI ENERGIA a seconda del sottolivello vibrazionale dello stato E0 che è implicato nel processo di transizione.
Quindi se l’ELETTRONE passa DIRETTAMENTE dallo STATO E1 allo STATO E0 ci sarà una certa EMISSIONE di RADIAZIONE LUMINOSA però l’elettrone potrebbe FERMARSI ad altri SOTTOLIVELLI VIBRAZIONALI all’interno dello STATO FONDAMENTALE.
Dal LIVELLO VIBRAZIONALE allo STATO BASALE si avrà di nuovo la CESSIONE di ENERGIA sotto forma di CALORE
Fosforescenza
Consente di VEDERE le RADIAZIONI LUMINOSE.
Per capire la DIFFERENZA tra FLUORESCENZA e FOSFORESCENZA bisogna prendere in considerazione lo STATO ECCITATO DI SINGOLETTO e lo STATO ECCITATO DI TRIPLETTO.
Lo stato eccitato di SINGOLETTO in cui si hanno gli elettroni con gli SPIN APPAIATI è legato al fenomeno della FOSFORESCENZA mentre lo stato eccitato di TRIPLETTO con gli elettroni che hanno gli SPIN SPAIATI è legato al fenomeno della FLUORESCENZA.
Lo stato eccitato di TRIPLETTO è più STABILE e quindi la FLUORESCENZA è un fenomeno che DURA più a LUNGO rispetto alla fosforescenza dal momento che ci vuole più tempo affinché l’elettrone torni allo stato fondamentale.
Quindi l’EMISSIONE DI RADIAZIONE LUMINOSA è PIU’ LENTA e LUNGA nel tempo
Diagramma dell’energia di Jablonski
La materia assorbe energia e gli elettroni vengono eccitati verso il primo o il secondo stato eccitato.
Successivamente ci sono dei fenomeni di RILASSAMENTO VIBRAZIONALE all’interno dello STESSO LIVELLO ENERGETICO oppure si ha la CONVERSIONE INTERNA quando gli elettroni passano da un livello energetico SUPERIORE a un livello energetico INFERIORE.
A partire dall’E1 si può anche avere l’EMISSIONE DI RADIAZIONE LUMINOSA (fluorescenza) oppure si può continuare ad avere un RILASSAMENTO NON RADIOATTIVO in cui l’elettrone torna allo STATO FONDAMENTALE cedendo l’eccesso di ENERGIA sotto forma di CALORE.
Un altro passaggio che può avvenire è l’INTERSYSTEM CROSSING cioè un PASSAGGIO TRA DUE SISTEMI DIVERSI dove l’elettrone nello stato eccitato di SINGOLETTO INVERTE lo SPIN e si trasforma nello stato eccitato di TRIPLETTO.
Lo stato eccitato di tripletto è più stabile e a seconda della molecola può avere un RILASSAMENTO NON RADIOATTIVO oppure l’emissione di FOSFORESCENZA.
Il fenomeno della FOSFORESCENZA si esplica in 10 alla -3 - 10 alla -2 s, mentre quello della FLUORESCENZA è molto più RAPIDO perché si esplica in 10 alla -9 - 10 alla -7 s.
Quando si allontana la sorgente luminosa la fosforescenza continua per un tempo molto maggiore rispetto a quello della fluorescenza.
La fluorescenza si vede solo quando è presente la sorgente luminosa
Resa quantica
E’ il RAPPORTO tra il NUMERO DI FOTONI EMESSE e il NUMERO DI FOTONI ASSORBITI.
Questo numero può variare fra 0 e 1.
Quanto MAGGIORE è la RESA QUANTICA quindi il NUMERO DI FOTONI EMESSI (=1) tanto MAGGIORE sarà la RADIAZIONE LUMINOSA che si riesce a rilevare con il fluorimetro e MAGGIORE sarà la SENSIBILITA’ della DETERMINAZIONE ossia anche con una scarsa quantità di materia si riesce a rilevare una radiazione che può essere facilmente registrabile
Fluorescenza primaria
Molecole che sono NATURALMENTE FLUORESCENTI (fluorescenza naturale o autofluorescenza).
Sono fluorescenti molecole che hanno NUMEROSI DOPPI LEGAMI CONIUGATI quindi grande delocalizzazione elettronica su uno spazio molto ampio.
Sono fluorescenti tutte le CLOROFILLE, molti PIGMENTI NATURALI, alcuni AA come Trp, Tyr e Phe, molti ENZIMI e COENZIMI (NAD, FAD), VITAMINE, molti FARMACI e MOLECOLE AROMATICHE, i POLICICLI AROMATICI e i loro derivati.
Il Trp ha un massimo di assorbimento a 280 nm ed emette fluorescenza a una lunghezza d’onda di 360 nm.
L’autofluorescenza è prodotta anche da sostanze che si trovano nelle cellule e si può registrare dopo un irraggiamento utilizzando un microscopio a fluorescenza
Fluorescenza secondaria
C’è la possibilità di INDURRE la FLUORESCENZA in molecole che non ne sono dotate.
Si può LEGARE a queste molecole un MARCATORE FLUORESCENTE detto FLUOROCROMO con un processo detto FLUOROCROMIZZAZIONE oppure si può indurre attraverso dei trattamenti chimici o chimico-fisici che rendono la molecola fluorescente.
Ci sono piccole MOLECOLE ORGANICHE o anche PROTEINE che sono FLUORESCENTI e possono essere LEGATE ad altre MOLECOLE per renderle FLUORESCENTI (es. famiglia cianine, fluoresceina).
Altri FLUOFORI ESTRINSECI possono essere PROTEINE che vengono CONIUGATE ad ALTRE PROTEINE.
Sia le molecole organiche, i fluorofori e le proteine fluorescenti possono essere coniugati ad altre molecole organiche tramite reazioni chimiche:
- tramite gruppi reattivi che reagiscono con gruppi amminici delle proteine (gruppo ε lisine) o gruppi tiolici cisteine
Green fluorescent protein (GFP)
E’ una PROTEINA FLUORESCENTE ESTRATTA da una MEDUSA che emette FLUORESCENZA (aequora victoria).
La FLUORESCENZA di questa proteina è dovuta ad una MODIFICA POST-TRADUZIONALE che porta ad un RIARRANGIAMENTO di 3 AA che sono la SERINA 65, la TIROSINA 66 e la GLICINA 67 che attraverso un processo di CICLIZZAZIONE, DEIDRATAZIONE e OSSIDAZIONE producono un FLUOROFORO che consente l’emissione di FLUORESCENZA.
La GFP ha una LUNGHEZZA D’ONDA di ECCITAZIONE di 475 nm e una LUNGHEZZA D’ONDA di EMISSIONE di 505 nm
Spettroscopia di fluorescenza
Consente di visualizzare specifiche STRUTTURE CELLULARI dotate di AUTOFLUORESCENZA ma anche di localizzare delle PROTEINE all’interno di preparati, tessuti, cellule andando a CONIUGARLE con MOLECOLE ORGANICHE o PROTEINE FLUORESCENTI.
La fluorescenza viene utilizzata anche per la preparazione di sonde per PCR real time, per preparare anticorpi
