PCR Flashcards
(9 cards)
Spettro di assorbimento del DNA
Il DNA sia esso a DOPPIA ELICA o a SINGOLO FILAMENTO mostra un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 260 nm dovuto alla presenza delle BASI AZOTATE PURINICHE e PIRIMIDINICHE, quindi MOLECOLE AROMATICHE con una serie di DOPPI LEGAMI CONIUGATI.
Il DNA a DOPPIA ELICA ha un ASORBIMENTO INFERIORE rispetto al DNA a SINGOLO FILAMENTO.
Quindi nel processo di DENATURAZIONE DEL DNA si assiste ad un EFFETTO IPERCROMICO cioè passando da dsDNA a ssDNA quindi attraverso un processo di DENATURAZIONE c’è un AUMENTO dell’ASSORBIMENTO.
Passando da una condizione di ssDNA a una condizione di dsDNA quindi un processo di RINATURAZIONE si va incontro ad un EFFETTO IPOCROMICO ossia una DIMINUZIONE del valore di ASSORBIMENTO
Curva di fusione
Si RISCALDA il DNA a DOPPIO FILAMENTO determinandone la DENATURAZIONE. Man mano che il DNA si DENATURA e quindi la DOPPIA ELICA si SEPARA in DUE SINGOLI FILAMENTI si assiste ad un AUMENTO dell’ASSORBIMENTO a 260 nm.
Infatti, AUMENTANDO la T AUMENTA progressivamente anche l’ASSORBIMENTO fino ad un ASSORBIMENTO MASSIMO che è quello a cui la DOPPIA ELICA è stata COMPLETAMENTE DENATURATA.
Nel grafico è indicata anche la Tm cioè la TEMPERATURA DI MELTING (T di funzione) che è il valore di T in corrispondenza del quale il DNA risulta essere DENATURATO al 50%. Quindi il 50% delle MOLECOLE di DNA sono DENATURATE mentre l’ALTRO 50% ancora NO.
La Tm dipende dalla COMPOSIZIONE IN BASI del DNA in quanto le BASI della DOPPIA ELICA di DNA sono COMPLEMENTARI (GC e AT).
Quando si parla di COMPLEMENTARITA’ DI BASI si parla di una COMPLEMENTARITA’ STRUTTURALE.
La GUANINA e la CITOSINA INTERAGISCONO fra loro tramite la formazione di 3 LEGANI H mentre l’ADENINA e la TIMINA interagiscono tramite la formazione di 2 LEGAMI H.
L’ENERGIA che si deve fornire per la SEPARAZIONE di una BASE G da una BASE C è MAGGIORE rispetto a quella che si deve fornire per SEPARARE una ADENINA da una TIMINA.
Quanto MAGGIORE è il CONTENUTO GC all’interno della molecola di DNA tanto MAGGIORE sarà la Tm.
Nel caso di un POLI AT, cioè un polinucleotide costituito da adenine e timine, la Tm risulta essere PIU’ BASSA rispetto ad un POLI GC, ossia un polinucleotide costituito da guanine e citosine.
C’è una SITUAZIONE INTERMEDIA di un DNA costituito da un 50% di basi AT e GC e più o meno la Tm di un classico DNA si aggira intorno agli 85-90°C
Da cosa dipende la Tm
La Tm dipende dalla CONCENTRAZIONE SALINA della SOLUZIONE in cui è presente il DNA.
Vedendo le curve di fusione si nota come all’AUMENTARE della CONCENTRAZIONE SALINA AUMENTA anche la Tm.
Ad una [10mM] di sale c’è una Tm di 72-73°C, con una [100mM] si passa ad una Tm di circa 85°C e a una [4M] ad una Tm di oltre 100°C.
Nel DNA le BASI sono RIVOLTE verso l’INTERNO dell’ELICA mentre uno SCHELETRO di GRUPPI ZUCCHERO e FOSFATO che sono rivolti all’ESTERNO.
I GRUPPI FOSFATI sono CARICHI NEGATIVAMENTE e queste CARICHE NEGATIVE tendono ad avere un effetto di REPULSIONE l’una rispetto all’altra però il DOPPIO FILAMENTO è STABILIZZATO dalla grande quantità di LEGAMI H che si instaurano tra le BASI. Tuttavia i GRUPPI FOSFATO con le loro CARICHE NEGATIVE hanno questo effetto che tenderebbe a favorire un ALLONTANAMENTO dei FILAMENTI.
Nel momento in cui è presente del SALE all’interno della soluzione, questi IONI CARICHI POSITIVAMENTE vanno a MASCHERARE le CARICHE NEGATIVE dei GRUPPI FOSFATO e STABILIZZANO ancor di più la STRUTTURA della DOPPIA ELICA.
AUMENTANDO la CONCENTRAZIONE SALINA la STRUTTURA della doppia elica risulta PIU’ STABILE quindi bisogna fornire una QUANTITA’ MAGGIORE di ENERGIA per determinarne la DENATURAZIONE
Cinetica di rinaturazione
Dopo aver denaturato il DNA si può anche RINATURARLO cioè il DNA riacquisisce la sua CONFORMAZIONE a DOPPIA ELICA.
La cinetica di rinaturazione del DNA è abbastanza complicata in quanto un DNA genomico è molto complesso in quanto ci sono zone che sono altamente ripetute, altre che sono moderatamente ripetute e altre ancora che sono uniche (geni che non sono presenti in copie multiple).
C’è una cinetica di rinaturazione che risulta essere piuttosto RAPIDA per il DNA ALTAMENTE RIPETUTO, una c. di rinaturazione con una VELOCITA’ INTERMEDIA per il DNA MODERATAMENTE RIPETUTO e la FASE PIU’ LENTA è quella di rinaturazione di SEQUENZE UNICHE di DNA perché si devono immaginare i filamenti che si muovono all’interno di una soluzione e devono ritrovare delle regioni complementari.
Quanto più sono NUMEROSE queste REGIONI DI COMPLEMENTARITA’ tanto più FACILE sarà la RIASSOCIAZIONE
Grafico: sulle ordinate è riportata la frazione di riassociazione, mentre sulle ascisse viene riportato il logaritmo di un parametro che viene indicato come Cot. Cot è il prodotto di C0 cioè la concentrazione del DNA all’inizio dell’esperimento e t che è il tempo di rinaturazione
La CINETICA DI RINATURAZIONE del DNA dipende dalla [DNA] e dal TEMPO che viene lasciato a disposizione al DNA per RITROVARE la sua CONFORMAZIONE e le REGIONI DI COMPLEMENTARITA’.
Per riuscire ad ottenere una RINATURAZIONE COMPLETA del DNA si deve partire da CONCENTRAZIONI di DNA abbastanza ELEVATE e lasciare che il TEMPO DI RINATURAZIONE sia abbastanza LUNGO perché è piuttosto DIFFICILE per SEQUENZE DI DNA UNICHE potersi RITROVARE e RIAPPAIARE.
Quanto MAGGIORE è la [DNA] tanto MAGGIORE è il TEMPO che viene lasciato a disposizione perché le REGIONE COMPLEMENTARI possano INCONTRARSI e MIGLIORE sarà la RINATURAZIONE
PCR: reazione a catena della polimerasi
E’ una sorta di riproduzione in vitro di un evento che avviene in natura, cioè quello della REPLICAZIONE DEL DNA.
I COMPONENTI di una REAZIONE di PCR sono
- STAMPO: dsDNS
- PRIMERS: sono dei CORTI OLIGONUCLEOTIDI che sono COMPLEMENTARI a REGIONI dei FILAMENTI di DNA che FIANCHEGGIANO la SEQUENZA DNA BERSAGLIO (sequenza target). Gli OLIGONUCLEOTIDI si devono APPAIARE alle DUE ESTREMITA’ 5’ dei FILAMENTI COMPLEMENTARI
- DEOSSIRIBONUCLEOTIDI TRIFOSFATI (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
- TAMPONE: consente all’ENZIMA di lavorare al MEGLIO della propria ATTIVITA’. Deve contenere CLORURO DI MAGNESIO dal momento che lo IONE Mg2+ è FONDAMENTALE per il FUNZIONAMENTO dell’ENZIMA
- ENZIMA: DNA POLIMERASI estratta da varie fonti
Confronto fra replicazione e PCR
C’è necessità di un DNA STAMPO, per la REPLICAZIONE è il DNA GENOMICO ma può esserlo anche per la PCR.
Si possono utilizzare anche FRAMMENTI di un DNA MENO COMPLESSI. L’importante è che lo STAMPO sia a DOPPIO FILAMENTO.
Lo STAMPO deve essere DENATURATO: in vivo ci pensa l’ELICASI mentre in vitro si utilizza la TEMPERATURA per favorire la SEPARAZIONE delle BASI.
L’ELEMENTO FONDAMENTALE è la presenza di PRIMERS OLIGONUCLEOTIDI che devono APPAIARSI in maniera COMPLEMENTARE a determinate SEQUENZE dello STAMPO e da quella POSIZIONE DI APPAIAMENTO parte la POLIMERIZZAZIONE. In natura ci sono dei PRIMERS a RNA che fungono da INNESCO per la POLIMERIZZAZIONE da parte della DNA POLIMERASI.
Nel caso della PCR si utilizza una DNA POLIMERASI TERMOSTABILE perché deve RESISTERE a TEMPERATURE ELEVATE e la POLIMERIZZAZIONE andrà sempre in DIREZIONE 5’-3’ su entrambi i FILAMENTI
DNA polimerasi
La DNA POLIMERASI utilizzata nella PCR deve essere un ENZIMA TERMOSTABILE dal momento che la REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI avviene a TEMèPERATURE abbastanza ELEVATE (da 60 fino a 90°C). Sono T alle quali un NORMALE ENZIMA PERDEREBBE la sua ATTIVITA’ dal momento che si DENATUREREBBE.
