Purificazione proteine Flashcards
(22 cards)
Funzioni proteine
Le proteine sono quelle che mediano tutti i processi che hanno luogo nelle cellule.
Se malfunzionanti impediscono il corretto funzionamento dell’organismo.
La funzione delle proteine è anche strettamente correlata alla loro struttura tridimensionale e quindi è importante realizzare degli studi di struttura delle proteine per capire qual è il ripiegamento che consente un adeguato funzionamento.
Per realizzare i vari studi è importante talvolta indispensabile avere delle proteine in FORMA PURA, quindi ISOLARE le PROTEINE dal contesto in cui si trovano.
Per fare questo si applicano una serie di tecniche
Principali steps nell’analisi delle proteine
- ESTRAZIONE delle PROTEINE dal materiale biologico di interesse
- PURIFICAZIONE di una PROTEINA di interesse
- CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE della proteina
PURIFICARE una PROTEINA significa averla in FORMA PURA, OMOGENEA cioè riuscire a ISOLARE una PROTEINA da tutto il contesto di proteine in cui si trova
Definire gli obiettivi
- Stabilire il GRADO DI PUREZZA necessario: se deve essere all’OMOGENEITA’ cioè PURA AL 100% oppure se si può TOLLERARE la CONTAMINAZIONE da qualche proteina estranea
- Stabilire la QUANTITA’ che serve
- Stabilire se recuperare una PROTEINA in FORMA ATTIVA o in FORMA DENATURATA
- Capire da quale TESSUTO, ORGANO o CELLULE partire per ottenere la maggior quantità di proteina di interesse
- Capire se ci sono CONTAMINANTI: quali sono e che caratteristiche hanno, quali rimuovere. E’ importante per scegliere al meglio i processi di purificazione
- Conoscere le CARATTERISTICHE della PROTEINA: PUNTO ISOLETTRICO, PM, STABILITA’, SOLUBILITA’, TEMPERATURA
- Sapere quali RISORSE ECONOMICHE ed UMANE sono a disposizione: quante persone possono lavorare e quanti soldi si hanno
- Avere dei METODI ANALITICI SEMPLICI per seguire la proteina nel corso della purificazione
Prima e seconda fase
- Bisogna avere più INFORMAZIONI POSSIBILI sulla PROTEINA che bisogna isolare
- Bisogna sapere QUANTA PROTEINA serve e in che GRADO DI PUREZZA e identificare la FONTE
- GRADO DI PUREZZA DESIDERATO: dipende dall’IMPIEGO che si deve fare della proteina.
Per alcune APPLICAZIONI (es. determinazione struttura 3D mediante cristallografia a raggi X) è richiesta la PUREZZA AL 100% (no contaminanti).
In alcuni casi si può TOLLERARE una PICCOLA % di CONTAMINANTI mentre in altri casi come la caratterizzazione dell’attività biologica si può sottostare ad un GRADO DI PUREZZA MENO FINE (l’importante è che l’enzima sia attivo e predominante sulle altre proteine) - FONTE DELLA PROTEINA DI INTERESSE: per ottenere GRANDI QUANTITA’ della proteina si sceglie il TESSUTO o l’ORGANO in cui questa proteina è presente in maggiore quantità.
Di solito si ricorre a SISTEMI IN VITRO che consentono di produrre grandi quantità di questa proteina e consentono di avere dei sistemi di purificazione un po’ privilegiati
Principi per la purificazione delle proteine
- Utilizzare TECNICHE DIFFERENTI per ogni STEP: la stessa tecnica può causare la perdita di parte del campione
- MINIMIZZARE il MANEGGIAMENTO del CAMPIONE ad ogni stadio: più si manipola il campione più si perde il materiale di interesse
- MINIMIZZARE l’USO di ADDITIVI che possono essere reagenti che possono migliorare e aiutare la purificazione ma che quando vengono rimossi possono causare perdita di materiale
- MINIMIZZARE il NUMERO degli STEPS
- COMBINARE gli STEPS logicamente
Bisogna arrivare al MIGLIOR RISULTATO POSSIBILE: anche solo un arricchimento della proteina, renderla in forma attiva e cercare di recuperarne la maggior quantità possibile
Grafico: resa finale di una serie di steps di purificazione, ciascuno dei quali ha una resa abbastanza alta
Si immagina che ogni step di purificazione possa avere una resa della proteina dell’80% cioè partendo da 1 mg di proteina se ne recupera 0.8 mg.
Recuperare un 80% della proteina di interesse a ogni step di purificazione è un risultato ottimo.
Bastano 8 steps di purificazione successivo con una resa dell’80% per cui si arriva ad avere una resa finale della proteina del 20%.
Quindi bisogna limitare il numero di steps e combinarli in maniera logica per cercare di recuperare la maggior quantità di proteina
Principali steps di purificazione
STEP DI CHIARIFICAZIONE: realizzando una OMOGENEIZZAZIONE del TESSUTO o ORGANO da cui si deve estrarre la PROTEINA di interesse si ottiene una SOSPENSIONE nella quale ci sono le proteine che si sono solubilizzate all’interno del tampone di estrazione, il particolato cellulare e i detriti cellulari che si devono eliminare. La CHIARIFICAZIONE viene effettuata attraverso uno step di CENTRIFUGAZIONE. Si ottiene il pellet che viene scartato e si lavora con il SUPERNATANTE che contiene le PROTEINE SOLUBILI e altri CONTAMINANTI
STEP DI ARRICCHIMENTO: si cerca di ALLONTANARE la maggior parte di proteine CONTAMINANTI ARRICCHENDO la FRAZIONE che si recupera della PROTEINA DI INTERESSA. L’arricchimento avviene tramite un passaggio di PRECIPITAZIONE FRAZIONATA
STEP DI PURIFICAZIONE INTERMEDIA: vengono impiegate tecniche cromatografiche a risoluzione sempre maggiore
STEP DI POLISHING: RECUPERO della PROTEINA in forma OMOGENEA (pura)
Nel progettare un esperimento di purificazione servono:
- un sistema per misurare le proteine totali del campione (es. metodi calorimetrici)
- sistemi per valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione (% proteina rispetto proteine totali)
- sistemi per identificare la proteina di interesse (es. metodi spettrofotometrici, immunologici)
Identificare
E’ importante disporre di un saggio che consenta di seguire la proteina nei vari step di purificazione.
Il saggio può essere enzimatico qualora si debba purificare un enzima si avrà a disposizione un saggio enzimatico che consente di verificare passaggio per passaggio di purificazione quante unità dell’enzima sono state recuperate di quel campione.
Se si ha a disposizione un anticorpo diretto contro la proteina si può seguire passaggio dopo passaggio la presenza della proteina nel campione realizzando un saggio immunologico cioè facendo reagire questa proteina con uno specifico anticorpo.
Si possono seguire le caratteristiche spettrofotometriche della proteina se ci sono dei cromofori che assorbono a specifiche lunghezze d’onda.
Si possono applicare saggi basati sulle proprietà chimico-fisiche della molecola
Parametri per il monitoraggio della qualità della purificazione
Si vanno a seguire DUE PARAMETRI
- RESA DELLA PROTEINA: si calcola facendo il RAPPORTO tra i mg della PROTEINA DI INTERESSE nella frazione recuperata DOPO un processo di PURIFICAZIONE e i mg della PROTEINA DI INTERESSE nel PREPARATO ORIGINALE (enzima: rapporto tra unità internazionale)
- ATTIVITA’ SPECIFICA: è il RAPPORTO tra le UNITA’ dell’ENZIMA DI INTERESSE nella frazione recuperata da un certo PASSAGGIO di PURIFICAZIONE rispetto ai mg di PROTEINE TOTALI nella FRAZIONE (% enzima rispetto proteine totali)
Nel corso di una PURIFICAZIONE OTTIMALE la RESA DIMINUISCE e l’ATTIVITA’ SPECIFICA AUMENTA.
La RESA DIMINUISCE perché step dopo step si PERDE una PARTE della PROTEINA DI INTERESSE rispetto a quella che poteva essere la sua QUANTITA’ nel CAMPIONE INIZIALE.
L’ATTIVITA’ SPECIFICA AUMENTA perché all’interno della FRAZIONE recuperata la MAGGIOR PARTE della QUANTITA’ PROTEICA deve essere rappresentata dall’ENZIMA o PROTEINA SPECIFICA
Passaggi intermedi di purificazione
Sono importanti quando si devono LEGARE tra loro PROCESSI di PURIFICAZIONE DIVERSI.
Si procede per STEP DIFFERENTI che prevedono l’utilizzo di TECNICHE DIVERSE.
Talvolta tra un passaggio e l’altro si rende necessario CONCENTRARE in termini di VOLUME il campione o realizzare un CAMBIO BUFFER cioè se il CAMPIONE è stato recuperato in un BUFFER ad ELEVATA CONCENTRAZIONE SALINA e nello step successivo di purificazione c’è bisogno di un campione in un TAMPONE a BASSA CONCENTRAZIONE SALINA si deve SOSTITUIRE il TAMPONE in cui il campione è solubilizzato.
A questo scopo ci sono DUE PROCESSI: DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE
Dialisi
Consiste in un processo di SEPARAZIONE di MACROMOLECOLE da PROTEINE PIU’ PICCOLE in processi spontanei tendenti all’equilibrio. Viene principalmente utilizzata per ALLONTANARE i SALI dalle SOLUZIONE DI MACROMOLECOLE (cambio buffer)
Vengono utilizzate delle MEMBRANE PERMEABILI a MOLECOLE di PICCOLE DIMENSIONI che sono caratterizzate da PICCOLI FORI che indicano il CUT OFF della membrana.
Il CUT OFF indica tutte le MOLECOLE che NON possono PASSARE attraverso i fori che sono presenti sulla superficie della membrana
Membrane permeabili
Normalmente queste membrane sono di CELLOFAN A POROSITA’ CONTROLLATA.
I TUBI DI CELLOFAN sono DISIDRATATI quindi si devono REIDRATARE sotto acqua corrente, successivamente si deve TAGLIARE una PORZIONE del TUBO PROPORZIONATA al VOLUME del CAMPIONE che si deve DIALIZZARE, si CHIUDE il TUBO sul FONDO con un NODO, si applica una MOLLETTA in modo da chiudere perfettamente il fondo del tubo e si RIEMPIE il TUBO con il CAMPIONE.
A questo punto si fa un NODO anche sul TOP del TUBO, si mette una MOLLETTA e il TUBO viene posto in un CONTENITORE con all’ESTERNO un TAMPONE che è quello contro il quale si vuole EQUILIBRARE la SOLUZIONE in cui è SOLUBILIZZATO il CAMPIONE DI INTERESSE
Processo della dialisi
Il sistema di dialisi viene utilizzato per SOSTITUIRE il BUFFER all’interno del quale è solubilizzato il campione.
Si immagina che il campione sia stato recuperato da uno step di purificazione in un TAMPONE ad ELEVATA CONCENTRAZIONE SALINA. Per passare allo step di purificazione successivo bisogna DIMINUIRE la CONCENTRAZIONE SALINA del tampone.
Quindi si deve DIALIZZARE contro un TAMPONE a BASSA CONCENTRAZIONE SALINA.
SI deve mettere il CAMPIONE all’interno del TUBO DA DIALISI in un BECKER contenente il TAMPONE contro il quale si vuole DIALIZZARE il campione.
Se la CONCENTRAZIONE SALINA del TAMPONE all’ESTERNO è molto PIU’ BASSA della CONCENTRAZIONE SALINA del TAMPONE in cui è presente il CAMPIONE, i SALI tenderanno ad USCIRE dalla SOLUZIONE INTERNA al TUBO DA DIALISI per andare all’ESTERNO fino a raggiungere una condizione di EQUILIBRIO (concentrazioni uguali).
Il CUT OFF del tubo da dialisi è tale per cui si IMPEDISCE alle MACROMOLECOLE PROTEICHE di USCIRE dal TUBO quindi quelle RIMANGONO nel TUBO e CAMBIA la CONCENTRAZIONE SALINA del TAMPONE in cui il CAMPIONE è stato SOLUBILIZZATO
Ripetizione dialisi
Formula concentrazione salina nel campione all’equilibrio
(Vcamp x c.salina camp) + (Vbuffer x c.salina buffer) / V totale
Se si ha un V di campione molto basso e si va a dializzare contro un V di buffer molto molto elevato ci si può aspettare che alla fine la concentrazione salina del campione all’interno del tubo da dialisi eguagli per lo più la concentrazione salina del buffer utilizzato per dializzarlo.
Qualora NON ci sia la possibilità di DIALIZZARE contro GRANDI VOLUMI di BUFFER si possono ripetere DUE o PIU’ STEP DI DIALISI ossia si fa procedere la dialisi per 8 ORE a TEMPERATUA AMBIENTE o a 4°C per preservare le caratteristiche di attività del campione poi dopo 8 ore si può CAMBIARE il BUFFER che si usa per la dialisi in modo tale da far RIPARTIRE il PROCESSO di EQUILIBRIO tra l’INTERNO e l’ESTERNO del TUBO DA DIALISI.
Se dopo il processo di dialisi si è arrivati all’EQUILIBRIO ma si vuole che la CONCENTRAZIONE SALINA nel TUBO DA DIALISI DIMINUISCA ancora si può CAMBIARE il BUFFER all’interno del BECKER in modo tale che partendo da un BUFFER a BASSA CONCENTRAZIONE SALINA si può far ripartire il processo di EQUILIBRIO fra l’INTERNO e l’ESTERNO del TUBO
Dializzatore a capillari
E’ costituito da 11-13000 CAPILLARI di ACETATO DI CELLULOSA che sono LUNGHI 13.5 cm con DIAMETRO INTERNO per ogni capillare di 225 µm e una PARETE SPESSA 30 µm che sviluppano una SUPERFICIE DIALIZZANTE di più di 1 m al quadrato.
Il sangue viene fatto passare attraverso questi capillari, all’esterno dei capillari viene fatto fluire controcorrente il liquido che ha la stessa composizione del plasma sanguigno in modo che tutte le scorie possano essere lavate via e il sangue possa essere rimesso in circolo nel paziente
Ultrafiltrazione
Si basa sull’impiego di MEMBRANE che consentono di SEPARARE MOLECOLE di DIMENSIONI PIU’ GRANDI da molecole di DIMENSIONI PIU’ PICCOLE.
Il processo non si blocca quando avviene l’EQUILIBRIO tra l’interno e l’esterno del tubo da dialisi ma viene facilitato dall’applicazione di una FORZA che spinge il SOLVENTE e le PICCOLE MOLECOLE ad ATTRAVERSARE la MEMBRANA.
E’ una tecnica che si utilizza per RIDURRE il VOLUME del CAMPIONE e mantenere la STESSA CONCENTRAZIONE SALINA all’INTERNO del CAMPIONE.
Si utilizzano delle MEMBRANE DA DIALISI che hanno uno SPECIFICO CUT OFF. Se si pensa alle MOLECOLE PICCOLE come IONI si consente una DIMINUZIONE del VOLUME del CAMPIONE nel PASSAGGIO attraverso la MEMBRANA ma lasciando la CONCENTRAZIONE SALINA del CAMPIONE INALTERATA
Amycon
Apparato per realizzare i processi di ultrafiltrazione. C’è una MEMBRANA con uno SPECIFICO CUT OFF in base alla necessità, un CONTENITORE dove si mette il CAMPIONE, una ANCORETTA MAGNETICA perché l’ultrafiltrazione viene realizzata sotto CONTINUA AGITAZIONE del CAMPIONE per fare in modo che il campione stesso non vada a precipitare sulla membrana stessa, un TAPPO dotato di una VALVOLA che viene collegato a un SISTEMA che consente di AUMENTARE la PRESSIONE all’INTERNO di questa CAMERETTA, poi c’è una STRUTTURA in METALLO che IMPEDISCE al TAPPO di SCHIZZARE VIA perché nel momento in cui si aumenta la pressione all’interno del sistema se il tappo non è trattenuto potrebbe schizzare via.
Quindi il processo di ULTRAFILTRAZIONE viene realizzato SOTTO PRESSIONE
Sartorium
C’è un CONTENITORE che è RIVESTITO e CIRCONDATO dalla MEMBRANA DA DIALISI. Si mette il CAMPIONE all’interno di questo contenitore con la membrana da dialisi, si ALLOGGIA all’INTERNO di un CONTENITORE PIU’ GRANDE, si applica il GAS con un’ELEVATA PRESSIONE e si FORZA il LIQUIDO a FLUIRE attraverso la MEMBRANA DA DIALISI in modo da RACCOGLIERLO sul FONDO del RECIPIENTE PIU’ GRANDE
Sistemi meno sofisticati che utilizzano delle pompe ad acqua
C’è una MEMBRANA DA DIALISI che viene posta come INTERFACCIA tra un CONTENITORE in cui si mette il CAMPIONE che si vuole ultrafiltrare e un CONTENITORE SOTTOSTANTE che è quello dove si va a RACCOGLIERE il CAMPIONE.
Il SISTEMA viene COLLEGATO ad una POMPA AD ACQUA che fa PASSARE il CAMPIONE dal CONTENITORE SUPERIORE a quello SOTTOSTANTE dove si può RECUPERARE
Centricon
Consentono di CONCENTRARE per CENTRIFUGAZIONE un CAMPIONE. Il campione viene applicato all’interno di PICCOLI SERBATOI. C’è una MEMBRANA DA DIALISI e il CAMPIONE viene forzato a PASSARE attraverso questa membrana mediante CENTRIFUGAZIONE e si recupera il CAMPIONE CONCENTRATO dal SERBATOIO
Condizioni per l’estrazione
Deve essere eseguita a FREDDO (BASSE TEMPERATURE) perché le proteine tendono a denaturarsi in seguito a surriscaldamento.
L’estrazione va fatta in presenza di un TAMPONE a BASSA FORZA IONICA che ricorda quella presente nelle cellule in modo tale che quelle PROTEINE che sono ben solubilizzate nel citoplasma cellulare continuino ad essere SOLUBILI anche nel TAMPONE DI ESTRAZIONE
A questo TAMPONE si aggiungono degli INIBITORI di PROTEASI (che andrebbero a degradare le proteine) e dell’EDTA che ha la funzione di CHELARE i METALLI in particolare Ca e Mg che fungono da COFATTORI di METALLOPROTEASI e quindi l’EDTA INIBISCE le PROTEASI.
Inoltre si aggiunge un DETERGENTE nel tampone di estrazione se si devono estrarre le PROTEINE DI MEMBRANA perché i detergenti hanno la struttura simile a quella dei fosfolipidi di membrana e quindi riescono a SOLUBILIZZARE meglio le PROTEINE nelle MEMBRANE.
Nel buffer di estrazione vengono aggiunti anche degli AGENTI RIDUCENTI come il DDT e il β-MERCAPTOETANOLO.
Il tampone di estrazione cerca di assomigliare al livello di FORZA IONICA e di caratteristiche di AMBIENTE RIDUCENTE alla CELLULA stessa.
La SEPARAZIONE delle PROTEINE si basa sulle loro CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE
- CARICA: punto isoelettrico che è determinato dalla COMPOSIZIONE IN AA BASICI e BASICI della proteina
- DIMENSIONE: peso molecolare
- POLARITA’: ci sono proteine più o meno POLARI in relazione alle caratteristiche degli AA della CATENA LATERALE (aa polari, idrofobici, aromatici)
- SOLUBILITA’: in soluzioni a SPECIFICHE CONCENTRAZIONI SALINE
- SPECIFICITA’: interazione di proteine con determinati LIGANDI (purificazione per affinità)
Usuali passi di purificazione
Bisogna avere dei sistemi di monitoraggio passaggio dopo passaggio della proteina di interesse.
Si parte dalla prima fase di OMOGENEIZZAZIONE del campione in cui si ESTRAGGONO tutte le PROTEINE presenti all’interno del campione. Nell’OMOGEINATO si possono vedere numerose BANDE PROTEICHE che rappresentano la complessità del campione.
Si applicano degli STEP di PURIFICAZIONE SUCCESSIVI (es. cromatografie) e si vede che il NUMERO di PROTEINE che CONTAMINANO quella di INTERESSE DIMINUISCE e AUMENTA step by step l’INTENSITA’ della PROTEINA DI INTERESSE fino ad arrivare ad uno STEP FINALE di PURIFICAZIONE in cui si riesce ad averla in OMOGENEITA’ e in DISCRETA QUANTITA’
