Struttura primaria delle proteine Flashcards
(34 cards)
Struttura primaria
Fa riferimento alla SEQUENZA AMMINOACIDICA della PROTEINA
Composizione amminoacidica
Significa determinare la TIPOLOGIA di AA che costituiscono una PROTEINA e la QUANTITA’ di questi AA.
La composizione amminoacidica non dice COME gli AA sono LEGATI tra loro, ma lo fa la SEQUENZA.
Per determinare la COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA si devono seguire TRE PASSAGGI PRINCIPALI:
1. Determinare un’IDROLISI COMPLETA della PROTEINA in maniera tale da avere una MISCELA di AA LIBERI all’interno della SOLUZIONE
2. SEPARARE gli AA presenti nell’idrolizzato
3. IDENTIFICARE e QUANTIFICARE i diversi AA
Idrolisi totale del peptide
L’idrolisi totale può essere realizzata utilizzando delle CONDIZIONI FORTEMENTE ACIDE in quella che viene definita IDROLISI ACIDA.
Si realizza con HCl 6 N (per HCl molarità e normalità coincidono) a 110°C per 24-72 ORE. Sono delle CONDIZIONI DRASTICHE che portano all’IDROLISI dei SINGOLI LEGAMI PEPTIDICI.
L’idrolisi può avvenire anche in CONDIZIONI BASICHE. In questo caso si utilizza NaOH 4.2 N (per NaOH M=N) oppure Ba(OH)2 4 N (per Ba(OH)2 N≠M in quanto 4N=2M) a 110°C per 16-70 ORE. Sono CONDIZIONI sempre DRASTICHE di reazione.
Un’alternativa può essere l’IDROLISI ENZIMATICA che si basa sull’utilizzo di ENZIMI. Di norma si possono usare AMMINOPEPTIDASI (enzimi che partono dall’N-terminale a rimuovere un aa alla volta) o CARBOSSIPEPTIDASI (enzimi che partendo dall’estremità C-terminale rimuovono un aa alla volta)
Idrolisi acida
E’ il metodo più comunemente utilizzato per l’analisi degli aa.
La PROTEINA viene SOLUBILIZZATA in una SOLUZIONE HCl 6M, viene posta in una PROVETTA DI VETRO e CHIUSA alla FIAMMA con una POMPA che ASPIRA completamente l’ARIA, quindi il CAMPIONE viene CHIUSO alla FIAMMA SOTTOVUOTO.
Prima di procedere a questo processo di chiusura della provetta, il CAMPIONE viene CONGELATO e SCONGELATO PIU’ VOLTE in maniera tale da consentire l’ALLONTANAMENTO dell’ARIA contenuta all’interno di esso.
Successivamente viene RISCALDATO a 110°C per un minimo di 24 ORE, volendo si possono realizzare delle idrolisi per tempi più lunghi.
Al TERMINE dell’idrolisi il TUBO viene ROTTO, il SOLVENTE viene fatto EVAPORARE e alla fine nella PROVETTA si trova l’insieme di AA che costituivano la provetta.
Il GRUPPO AMMINICO N-TERMINALE del PEPTIDE in condizioni di HCl 6M è CARICO POSITIVAMENTE perché ci si trova in CONDIZIONI FORTEMENTE ACIDE. In queste condizioni c’è anche una tendenza alla PROTONAZIONE dell’OSSIGENO della FUNZIONE CARBONILICA del LEGAME PEPTIDICO. Per RISONANZA ci possono essere DUE POSSIBILI FORME dove l’ELETTRONEGATIVITA’ dell’OSSIGENO porta a creare un ECCESSO di CARICA POSITIVA sul C che diventa SUSCETTIBILE all’ATTACCO da parte dell’ACQUA. Per questo si parla di IDROLISI ACIDA: ci si trova in CONDIZIONI ACIDE e la ROTTURA DEL LEGAME PEPTIDICO è indotta dall’ACQUA.
Alla fine si ottiene una MISCELA di AA LIBERI tutti CARICHI POSITIVAMENTE perché le CONDIZIONI sono FORTEMENTE ACIDE.
Queste condizioni di idrolisi sono piuttosto DRASTICHE e possono portare al DANNEGGIAMENTO e alla PERDITA di ALCUNI AA. Ci sono alcuni AA come la SERINA, la TREONINA e la TIROSINA che nella CATENA LATERALE presentano un GRUPPO OSSIDRILICO che hanno una PERDITA del 10% (Ser) e del 5% (Thr e Tyr) DOPO l’IDROLISI.
Altri AA come il Trp subiscono un’IDROLISI COMPLETA PER OSSIDAZIONE, ma anche altri AA come Cys, cistina, Asp, Glu e Met possono SUBIRE delle MODIFICAZIONI CHIMICHE
Modificazioni chimiche durante l’idrolisi acida
- Il TRIPTOFANO subisce una sorta di DISTRUZIONE. In presenza di OSSIGENO sono possibili dei fenomeni di OSSIDAZIONE che portano alla DISTRUZIONE dell’OSSITRIPTOFANO, GLICINA, ALANINA. Vengono STACCATE delle PARTI dell’AA stesso
- La CISTEINA può subire OSSIDAZIONE ad ACIDO CISTEICO. Il GRUPPO TIOLICO SH si trasforma in SO3H
- La CISTINA (cioè due cisteine unite da un ponte disolfuro) può essere RIDOTTA e formare DUE CISTEINE e poi le CISTEINE possono subire l’OSSIDAZIONE AD ACIDO CISTEICO
- L’ASPARAGINA e la GLUTAMMINA sono DUE AA che vanno facilmente incontro a DEAMINAZIONE SPONTANEA. L’ASPARAGINA si trasforma in ACIDO ASPARTICO e la GLUTAMMINA in ACIDO GLUTAMMICO. Può essere difficile quantificare adeguatamente questi aa perché si trovano sotto forma di acido
- La METIONINA può essere riconosciuta come METIONIN SULFOSSIDO e METIONIN SULFONE perché può andare incontro a dei fenomeni di OSSIDAZIONE
Quando si va a ricostruire la composizione amminoacidica bisogna essere consapevoli di queste possibili alterazioni a cui possono andare incontro gli aa
Accorgimenti per il dosaggio degli aa soggetti a perdita
SERINA, TREONINA e TIROSINA tendono a subire una PERDITA del 5-10% sotto queste condizioni di reazione.
Quindi per risalire alla CONCENTRAZIONE, la quantità effettiva di queste aa, si può utilizzare il METODO DELL’ESTRAPOLAZIONE GRAFICA al TEMPO 0.
Si preparano TRE CAMPIONI UGUALE della PROTEINA di cui si deve determinare la COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA e si realizza un’IDROLISI ACIDA per TEMPI DIVERSI: 24 ORE, 48 ORE e 72 ORE.
A questo punto si fa il DOSAGGIO dei TRE AA in TUTTI e tre i CAMPIONI. Si costruisce un GRAFICO in cui si riporta la CONCENTRAZIONE DEGLI AA in funzione del TEMPO cioè delle ORE di IDROLISI ACIDA.
A 72 ORE la CONCENTRAZIONE dei TRE AA sarà PIU’ BASSA e progressivamente PIU’ ALTA a 48 e 24 ORE.
Quindi si può ESTRAPOLARE al TEMPO 0 tracciando la retta che congiunge i punti messi nel grafico cercando di desumere quella che può essere la CONCENTRAZIONE INIZIALE dell’AA nella miscela sulla base dell’andamento della retta.
Il TRIPTOFANO viene DISTRUTTO quasi completamente quindi per EVITARE la DISTRUZIONE invece di realizzare un’idrolisi acida con HCl 6M si potrebbero utilizzare altri ACIDI che sono ugualmente FORTI ma MENO OSSIDANTI dell’HCl (acido metansolfonico, acido p-toluensolfonico, acido mercaptoetansolfonico).
Oppure si può realizzare un’IDROLISI ALCALINA.
La CISTINA e la CISTEINA vanno incontro a fenomeni di OSSIDAZIONE del GRUPPO TIOLICO ad ACIDO CISTEICO. Di norma si vanno a DERIVATIZZARE le CISTEINE. Si RIDUCONO i PONTI DISOLFURO, si ottengono quindi i GRUPPI TIOLICI LIBERI. A questo punto il GRUPPO TIOLICO viene specificamente DERIVATIZZATO in maniera tale che la CISTEINA possa essere RICONOSCIUTA come uno SPECIFICO PRODOTTO DI DERIVATIZZAZIONE.
La DERIVATIZZAZIONE può essere realizzata con ACIDO PERFORMICO (acido formico HCOOH, l’acido performico ha un ossigeno in più) che alla ROTTURA del PONTE DISOLFURO e all’OSSIDAZIONE delle CISTEINE ad ACIDO CISTEICO.
Derivatizzando le cisteine in questo modo, nella MISCELA si va a ricercare la CISTEINA sotto forma di ACIDO CISTEICO. La QUANTITA’ DI ACIDO CISTEICO dà la misura di quelle che vengono chiamate le MEZZE CISTINE. NON si possono più DISTINGUERE le CISTERNE LEGATE a formare i PONTI DISOLFURO e quelle che NON lo erano. Quindi complessivamente si dice che il DOSAGGIO è relativo a MEZZE CISTINE.
Ci sono altre modalità di derivatizzazione della cisteina. I GRUPPI TIOLICI sono dei GRUPPI MOLTO REATTIVI e prima di fare delle analisi strutturali sulle proteine di norma vengono sempre derivatizzati per rendere queste CISTEINE MENO REATTIVE. Una volta che il GRUPPO TIOLICO è stato trasformato in un GRUPPO MENO REATTIVO, si STABILIZZA l’AA.
Il fatto di RIDURRE i PONTI DISOLFURO di una PROTEINA e poi DERIVATIZZARE i GRUPPI TIOLICI con SPECIFICI GRUPPI FUNZIONALI CHIMICI è un processo importante.
L’ACIDO PERFORMICO è in grado di ROMPERE i PONTI DISOLFURO e OSSIDARE il GRUPPO TIOLICO ad ACIDO CISTEICO. In altri sistemi di derivatizzazione delle cisteine prima si devono ridurre i ponti disolfuro. La formazione di un ponte disilduro è un processo di ossidazione fra due gruppi tiolici di una proteina mentre la rottura del ponte disolfuro è un processo di riduzione. Quella che avviene è una reazione di OSSIDORIDUZIONE che prevede lo scambio tra specie, una ossidante e una riducente.
La RIDUZIONE dei PONTI DISOLFURO delle proteine viene realizzata utilizzando degli AGENTI RIDUCENTI. Gli AGENTI RIDUCENTI sono per esempio il β-MERCAPTOETANOLO (sul Cβ c’è un gruppo mercapto quindi tiolico).
Il β-MERCAPTOETANOLO ha il ruolo di AGENTE RIDUCENTE perché nel momento in cui si va a ridurre il ponte disolfuro quindi si va a ROMPERE il LEGAME e a fornire ELETTRONI e PROTONI, si ha la formazione di DUE CISTEINE, ma al contempo da DUE MOLECOLE di β-MERCAPTOETANOLO RIDOTTO si forma una MOLECOLA di β-MERCAPTOETANOLO OSSIDATO. Visto che è una reazione di ossidoriduzione c’è un agente riducente che è il β-mercaptoetanolo e un agente ossidante che è la cistina.
Quindi c’è uno SCAMBIO DI DISOLFURI, si ROMPE un DISOLFURO ma al contempo se ne forma un altro da DUE MOLECOLE di β-MERCAPTOETANOLO RIDOTTO.
Questa reazione di ossidoriduzione consente di ridurre o di formare dei ponti disolfuro. Si può anche utilizzare il β-MERCAPTOETANOLO OSSIDATO per favorire la formazione di un ponte DISOLFURO fra DUE RESIDUI di CISTEINA e si ottiene la LIBERAZIONE di DUE MOLECOLE di β-MERCAPTOETANOLO RIDOTTO.
Un’altra molecola che favorisce la RIDUZIONE o la FORMAZIONE di un PONTE DISOLFURO fra CISTEINE è il DITIOTREITOLO (4C due dei quali legati a un gruppo OH e due legati a un gruppo tiolico, 2 gruppi OH e due gruppi tiolici).
Quando si va a RIDURRE il PONTE DISOLFURO si ha uno SCAMBIO di DISOLFURI fra il DITIOTREITOLO e la CISTINA. Il PONTE DISOLFURO si forma INTRAMOLECOLARMENTE all’interno della molecola di DITIOTREITOLO perché questo è dotato di DUE GRUPPI TIOLICI. La quantità di DTT che serve per RIDURRE una determinata quantità di PONTI DISOLFURO di una proteina è pari alla META’ di quella di β-MERCAPTOETANOLO dal momento che il DTT ha già DUE GRUPPI TIOLICI insiti nella sua molecola mentre nel β-MERCAPTOETANOLO ce n’è UNO solo.
Dopo aver RIDOTTO il PONTE DISOLFURO si va a DERIVATIZZARE il GRUPPO TIOLICO della CISTEINA che è un GRUPPO MOLTO REATTIVO.
Qualora ci fossero delle condizioni ideali il gruppo tiolico della cisteina potrebbe riformare un ponte disolfuro. Nel caso in cui si stanno facendo delle analisi di struttura primaria della proteina bisogna evitare che questo gruppo possa nuovamente reagire.
Per cui può essere DERIVATIZZATO con ACIDO IODOACETICO formando la CARBOSSIMETILCISTEINA.
Oppure può essere DERIVATIZZATO con 4-VINILPIRIDINA (dopo la riduzione del ponte disolfuro) che si lega al GRUPPO TIOLICO formando la PIRIDILETILCISTEINA.
Oppure si può DERIVATIZZARE il GRUPPO TIOLICO utilizzando l’ETILENIMMINA che reagendo con il gruppo tiolico forma l’AMMINOETILCISTEINA
Separazione, identificazione e quantificazione degli aa nell’idrolizzato
Una volta realizzata l’idrolisi della proteina e aver messo in pratica tutte le operazioni per effettuarla (derivatizzazione cisteine, estrapolazione grafica al tempo 0), si vanno a SEPARARE gli AA presenti nell’idrolizzato per poi identificarli e quantificarli.
La SEPARAZIONE avviene utilizzando una COLONNA CROMATOGRAFICA. Nel momento in cui questi AA ELUISCONO, bisogna essere in grado di RICONOSCERE il MOMENTO in cui un certo AA ESCE con l’ELUATO.
Gli AA (tranne quelli aromatici) NON hanno ASSORBIMENTO che si può misurare nell’UV o nel visibile. Solo Trp, Phe e Tyr hanno proprietà di assorbimento a 280 nm. Quindi per rendere OTTICAMENTE MISURABILI gli ALTRI AA bisogna DERIVATIZZARLI cioè realizzare una REAZIONE CHIMICA che li CONIUGHI con una MOLECOLA che sia OTTICAMENTE RILEVABILE. Questo processo di DERIVATIZZAZIONE può essere realizzato PRE-COLONNA o POST-COLONNA.
La derivatizzazione PRE-COLONNA significa che si CONIUGA l’AA con una MOLECOLA OTTICAMENTE RILEVABILE prima di realizzare la SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA.
In alternativa si può far REAGIRE l’AA che ESCE dalla COLONNA CROMATOGRAFICA con un REATTIVO che lo renda VISIBILE
Derivatizzazione pre-colonna
Possono essere utilizzati reagenti di vario genere. Sono delle MOLECOLEdotate di ANELLI AROMATICI quindi hanno un ASSORBIMENTO nell’UV se non anche nel VISIBILE.
Quanti PIU’ DOPPI LEGAMI ci sono tanto PIU’ è ELEVATA la λ che ASSORBE.
Tra queste molecole ci sono DABSIL CLORURO, DANSIL CLORURO, l’OFTALDEIDE (OFA) e il FENILISOTIOCIANATO (PITC)
Separazione mediante RP-HPLC di aa derivatizzati con PITC
Gli AA DERIVATIZZATI con PITC hanno degli SPECIFICI TEMPI DI RITENZIONE.
Si utilizza una CROMATOGRAFIA DI FASE INVERSA perché queste MOLECOLE sono IDROFOBICHE. In relazione alla natura degli aa questi saranno più o meno trattenuti dalla colonna cromatografica.
Gli AA ACIDI sono quelli che ESCONO per PRIMI seguiti dall’ISTIDINA e dalla LISINA e poi gli ALTRI.
In genere si realizza una CORSA con degli STANDARD, a questi bisogna AGGIUNGERE degli STANDARD con le opportune DERIVATIZZAZIONI (es. cisteina).
In questa maniera ogni AA in queste condizioni cromatografiche ha un suo SPECIFICO TEMPO DI RITENZIONE.
Tramite il tR si può IDENTIFICARE quale AA sta USCENDO dalla COLONNA.
Gli STANDARD in genere sono anche degli STANDARD DI CONCENTRAZIONE cioè si CARICA una determinata QUANTITA’ (250 picomoli) di OGNUNO degli AA STANDARD e si ottengono dei PICCHI di ALTEZZA DIVERSA.
Calcolando l’AREA dei PICCHI e mettendola in relazione all’AREA dell’AA DI INTERESSE che si rileva dalla colonna cromatografica, si può determinare la CONCENTRAZIONE DI AA all’interno della PROTEINA.
Quindi gli standard servono sia per riconoscere gli aa attraverso il tR nel sistema cromatografico che si sta utilizzando sia per dosarli, per determinanarne la concentrazione facendo un confronto fra le aree dei picchi
Separazione mediante RP-HPLC di aa derivatizzati con OPA
L’ASPARTICO e il GLUTAMMICO sono i PRIMI che ESCONO, di norma quelli ACIDI in queste condizioni ESCONO sempre per PRIMI
Derivatizzazione post-colonna
L’IDROLIZZATO viene CARICATO sulla COLONNA e la REAZIONE con una MOLECOLA che lo OTTICAMENTE RILEVABILE viene realizzata quando esso ELUISCE dalla COLONNA CROMATOGRAFICA.
In seguito all’IDROLISI ACIDA tutti gli AA sono CARICHI POSITIVAMENTE in queste condizioni di idrolisi. Di conseguenza si possono SEPARARE utilizzando una CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO, in particolare a SCAMBIO CATIONICO perché gli AA sono CARICHI POSITIVAMENTE.
Si deve utilizzare una MATRICE CARICA NEGATIVAMENTE (uno scambiatore cationico) e che sia uno SCAMBIATORE FORTE dal momento che si lavora ad un pH BASSISSIMO circa 2. Quindi bisogna utilizzare uno scambiatore forte che in queste condizioni risulta essere DISSOCIATO.
Il più utilizzato è il GRUPPO SOLFORICO, il POLISTIRENE SOLFONATO come GRUPPO FUNZIONALE della MATRICE.
A questo punto si CARICANO gli AA sulla MATRICE, questi INTERAGISCONO più o meno fortemente con la MATRICE in relazione alle caratteristiche della CATENA LATERALE e si realizza un’ELUIZIONE con GRADIENTE DI pH o FORZA IONICA.
C’è un ORDINE PRECISO di ELUIZIONE degli AA che prevede che gli AA ACIDI ESCANO per PRIMI, poi quelli NEUTRI e infine quelli BASICI.
Gli AA ACIDI sono quelli che si STACCANO per PRIMI in quanto il GRUPPO CARBOSSILICO nella CATENA LATERALE COOH si IONIZZA molto velocemente a COO- (intorno a pH 3-3.5 questi iniziano ad essere respinti dalla matrice), poi gli AA NEUTRI e per ultimi quelli BASICI che hanno un pI MAGGIORE rispetto agli altri.
Man mano che ESCONO dalla COLONNA questi AA REAGISCONO con NINIDRINA a 100°C. La niridrina è un COMPOSTO TRICHETONICO ed esiste IN EQUILIBRIO con la sua FORMA IDRATA. La niridrina viene chiamata 1,2,3-TRICHETOIDRINDENE.
In seguito all’ELUIZIONE l’AA è CARICO NEGATIVAMENTE perché il pH è stato AUMENTATO per favorire l’ELUIZIONE degli AA. Il GRUPPO AMMINICO NON PROTONATO REAGISCE con uno dei GRUPPI CARBONILICI della NIRIDRINA a formare una CHETIMMINA con l’ELIMINAZIONE di una MOLECOLA D’ACQUA. La chetimmina va incontro ad una DECARBOSSILAZIONE SPONTANEA IRREVERSIBILE quindi PERDE il GRUPPO CO2 e si trasforma in un’ALDIMMINA. L’aldimmina va incontro ad un fenomeno di IDROLISI per cui ESCE il GRUPPO ALDEIDICO e rimane un’AMMINA INTERMEDIA. Uscendo questo gruppo è stata persa la catena laterale dell’aa. A questo punto l’ammina intermedia può entrare IN EQUILIBRIO con un’altra forma, l’IDRINDANTINA con l’USCITA del GRUPPO AMMINICO. Questa è una REAZIONE REVERSIBILE.
L’AMMINA INTERMEDIA può REAGIRE con un’altra molecola di NIRIDRINA a formare il PRODOTTO FINALE della REAZIONE che è la PORPORA DI RUHEMANN. La porpora di Ruhemann ha un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 570 nm per cui al TERMINE della REAZIONE con la niridrina si ha la formazione di una MOLECOLA che è costituita da DUE MOLECOLE di NIRIDRINA che sono LEGATE COVALENTEMENTE all’AZOTO AMMINICO dell’AA. Al termine della reazione quello che RIMANE dell’AA è l’AZOTO AMMINICO.
Nel caso della PROLINA la reazione è DIFFERENTE perché la prolina è un IMMINOACIDO e quindi si forma un altro CROMOFORO con una λ MASSIMA di 440 nm.
Man mano che gli AA ESCONO si fanno REAGIRE con la NIRIDRINA e si possono RILEVARE.
Gli AA vengono DISTINTI in base al tR. Ogni AA ESCE dalla colonna ad uno SPECIFICO TEMPO, REAGISCE con la NIRIDRINA e in base a questo tR può essere IDENTIFICATO.
Anche in questo caso si realizza una CORSA DI STANDARD in cui sono stati CARICATI tutti gli AA sulla CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO CATIONICO e si osservano PICCHI relativi a CIASCUNO degli AA. L’ALTEZZA del PICCO sarà relativa alla QUANTITA’ di AA presente.
Quindi mettendo a confronto il tR dell’AA che ESCE dalla COLONNA CROMATOGRAFICA con il tR degli AA STANDARD, si può IDENTIFICARE l’AA in questione e mettendo a confronto le AREE dei PICCHI si può determinarne la QUANTITA’.
Ad un certo tR ESCE l’ASPARTICO ad un pH FORTEMENTE ACIDO (3.25), poi GLICINA e ALANINA sono AA NEUTRI che ESCONO per SECONDI e poi l’ISTIDINA e l’ARGININA che ESCONO per ULTIMI
Dosaggio degli aa nei liquidi fisiologici
Gli AA vengono fatti REAGIRE con delle MOLECOLE e QUANTIFICATI nei LIQUIDI FISIOLOGICI.
Monitorare le CONCENTRAZIONI di SPECIFICI AA può essere utile per la DIAGNOSI DI MALATTIE come autismo, disturbo bipolare, depressione. Sono malattie che portano all’alterazione delle concentrazioni di specifici aa nei fluidi biologici.
Dalla presenza nell’URINA degli AA CITRULLINA e OMOCITRULLINA si può supporre la presenza di PROBLEMI GASTROINTESTINALI.
Oppure INSUFFICIENZE di determinati AA possono indicare CARENZE DI VITAMINE.
C’è la possibilità di realizzare delle DIAGNOSI andando a DOSARE la CONCENTRAZIONE di AA nei fluidi biologici.
La FENILCHETONURIA è una malattia dovuta all’ASSENZA o DEFICIENZA di un ENZIMA chiamato FENILALANINA IDROSSILASI che catalizza la trasformazione della FENILALANINA in TIROSINA.
La Phe viene IDROSSILATA e si ha la formazione di Tyr.
Se c’è una CARENZA di questo enzima si ha un AUMENTO della Phe nei fluidi biologici dal momento che questa NON viene trasformata in Tyr.
La FENILCHETONURIA si manifesta clinicamente nelle PRIME SETTIMANE dopo la NASCITA e se NON viene TRATTATA prontamente provoca GRAVI FORME di RITARDO MENTALE nel neonato. Per questo nei bambini appena nati si preleva una gocciolina di sangue dal tallone per fare il dosaggio della Phe.
La CISTINURIA è una malattia genetica caratterizzata dall’ACCUMULO e dalla FORMAZIONE di CALCOLI DI CISTINA nel RENE, nell’URETERE e nella VESCICA. La CISTINA è un AA che viene spesso DOSATO per fare delle DIAGNOSI.
Il sistema con cui questi AA vengono DOSATI è quello di farli REAGIRE con la NIRIDRINA in maniera tale da renderli OTTICAMENTE RILEVABILI e sulla base di STANDARD viene determinata la CONCENTRAZIONE di questo SPECIFICO AA all’interno del fluido biologico
Determinazione della struttura primaria di peptidi e proteine
Quando si parla di STRUTTURA PRIMARIA non si fa riferimento solo alla DETERMINAZIONE della SEQUENZA AMMINOACIDICA ma anche alla POSIZIONE dei PONTI DISOLFURO. La struttura primaria comprende tutto il complesso dei LEGAMI COVALENTI che caratterizzano una proteina.
La prima cosa da fare è capire se la PROTEINA è MONOMERICA o se è costituita da PIU’ SUBUNITA’. Qualora si abbiano UNA o PIU’ SUBUNITA’, una o più CATENE POLIPEPTIDICHE che costituiscono una PROTEINA si devono SEPARARE e si deve fare l’ANALISI SEPARATAMENTE.
Nella SINGOLA CATENA bisogna procedere con la RIDUZIONE dei PONTI DISOLFURO e la DERIVATIZZAZIONE o ALCHILAZIONE dei GRUPPO TIOLICI delle CISTEINE (RIDUZIONE con AGENTI RIDUCENTI e poi DERIVATIZZAZIONE con AGENTI CHIMICI dei GRUPPI TIOLICI delle cisteine).
Successivamente le PROTEINE devono essere SCISSE in PEPTIDI, quindi devono essere sottoposte a delle IDROLISI CHIMICHE o ENZIMATICHE.
Per la PROTEOLISI (idrolisi della proteina) si devono utilizzare DUE METODI DIFFERENTI in modo tale da ottenere FRAMMENTI di LUNGHEZZE DIVERSE. E’ proprio grazie a questa DIFFERENTE LUNGHEZZA che si può RICOSTRUIRE la SEQUENZA. Si devono SEPARARE i SINGOLI PEPTIDI ottenuti.
Si deve fare l’ANALISI della SEQUENZA di ciascun PEPTIDE.
Infine si devono ALLINEARE queste SEQUENZE in modo tale da RICOSTRUIRE tutta la SEQUENZA della PROTEINA. Laddove TERMINA la SEQUENZA di un PEPTIDE, questo peptide può essere PIU’ LUNGO nell’ALTRA MISCELA (stessa catena divisa in peptidi con metodi di idrolisi differenti, quindi si formano frammenti di differenti lunghezze) in maniera tale da poter fare degli OVERLAP delle SEQUENZE dei FRAMMENTI ottenuti dalle DUE IDROLISI DIFFERENTI che consentono di ESTENDERE la SEQUENZA e quindi RICOSTRUIRLA
Determinazione del ponte disolfuro
Una volta IDENTIFICATA la SEQUENZA dei FRAMMENTI attraverso dei sistemi si procede alla DETERMINAZIONE del PONTE DISOLFURO.
Il primo passaggio è un’ELETTROFORESI IN CONDIZIONI RIDUCENTI e NON RIDUCENTI per determinare il PM della PROTEINA e verificare se sia OLIGOMERICA. Infatti il primo step è di capire se la PROTEINA è costituita da UNA o PIU’ CATENE POLIPEPTIDICHE e se queste siano UNITE da PONTI DISOLFURO.
Si realizza un SDS-PAGE in presenza di AGENTI RIDUCENTI come DTT o β-MERCAPTOETANOLO.
Se da una SINGOLA PROTEINA in seguito a RIDUZIONE o DENATURAZIONE si ottiene la SEPARAZIONE di DUE BANDE significa che la PROTEINA è costituita da DUE CATENE POLIPEPTIDICHE. In questo caso devono essere SEPARATE l’una dall’altra in maniera tale da ANALIZZARE in modo INDIPENDENTE.
Il fatto che le DUE CATENE si siano LIBERATE in seguito all’AGGIUNTA di un AGENTE RIDUCENTE alla MISCELA significa anche che le DUE CATENE sono unite da un PONTE DISOLFURO.
Se invece fossero state LIBERATE DUE CATENE realizzando solo l’SDS-PAGE SENZA l’AGGIUNTA di AGENTI RIDUCENTI, si sarebbe dedotto che le CATENE erano UNITE da INTERAZIONI PIU’ DEBOLI.
La PRIMA ANALISI ELETTROFORETICA consente di capire qual è la STRUTTURA QUATERNARIA della PROTEINA.
Una volta ottenuta la SINGOLA CATENA, si vanno a RIDURRE i PONTI DISOLFURO e ad ALCHILARE i GRUPPI TIOLICI. Indipendentemente dalla presenza di ponti disolfuro i GRUPPI TIOLICI vanno comunque ALCHILATI perché sono dei GRUPPI REATTIVI.
La RIDUZIONE dei GRUPPI TIOLICI viene realizzata utilizzando degli AGENTI RIDUCENTI.
Il DTT riduce il PONTE DISOLFURO cosicché si possa procedere con la DERIVATIZZAZIONE per esempio con lo iodoacetato che porta alla formazione di carbossimetilcisteina.
In alternativa si può realizzare un’ossidazione con acido performico che rompe il ponte disolfuro e ossida il gruppo tiolico ad acido cisteico
Frammentazione
Una volta ridotti i ponti disolfuro e alchilati i gruppi tiolici delle cisteine, si va a realizzare la SCISSIONE della PROTEINA in PEPTIDI quindi a realizzare una reazione di PROTEOLISI sulla proteina.
Ci sono vari METODI per realizzare la PROTEOLISI: CHIMICI ed ENZIMATICI
Frammentazione con metodi chimici
Per quanto riguarda i METODI CHIMICI si può realizzare un’IDROLISI ACIDA PARZIALE. Si utilizza HCl anche in CONCENTRAZIONE ELEVATA 7N, 12N per TEMPI molto PIU’ BREVI rispetto a quelli utilizzati nell’idrolisi acida totale che viene utilizzata nella determinazione della composizione amminoacidica di una proteina.
I TEMPI sono DIVERSI per il fatto che non si vogliono separare tutti gli aa altrimenti non si potrebbe più ricostruire la sequenza.
Si vogliono ottenere dei FRAMMENTI. Un’idrolisi i questo tipo produce dei FRAMMENTI CASUALI, la PROTEINA viene TAGLIATA CASUALMENTE in determinati PUNTI.
Un’alternativa all’idrolisi acida è il TRATTAMENTO della PROTEINA con il BROMURO DI CIANOGENO.
Il bromuro di cianogeno è un AGENTE CHIMICO che RICONOSCE i RESIDUI di METIONINA e TAGLIA la PROTEINA in corrispondenza di questi RESIDUI. Il DOPPIETTO ELETTRONICO presente sullo ZOLFO del RESIDUO di METIONINA va a realizzare un ATTACCO NUCLEOFILO sul C del GRUPPO CIANO del BROMURO DI CIANOGENO. Si ha l’uscita del BROMO e il LEGAME del GRUPPO CIANO con il residuo di METIONINA.
A questo punto c’è lo SPOSTAMENTO dei DOPPIETTI ELETTRONICI per cui si viene a creare un ANELLO con USCITA del GRUPPO del METILTIOCIANATO.
L’ACQUA del MEZZO in cui si sta conducendo la reazione favorisce la DISSOCIAZIONE e la ROTTURA del LEGAME PEPTIDICO grazie all’ECCESSO DI CARICA POSITIVA sull’AZOTO che diventa un GRUPPO ATTACCABILE dalla MOLECOLA D’ACQUA con l’ECCESSO DI CARICA NEGATIVA sull’OSSIGENO.
Si ha la SCISSIONE della proteina con l’AA Met che si è trasformata in una OMOSERINA dal momento che il gruppo metiltiocianato è uscito.
Omoserina perché la serina nella catena laterale è CH2OH e questa è invece CH2CH2OH.
L’OMOSERINA può CICLIZZARE per PERDITA di una MOLECOLA D’ACQUA formando l’OMOSERINA LATTONE. E’ un ESTERE CICLICO in cui si ha la REAZIONE di un GRUPPO CARBOSSILICO con un GRUPPO ALCOLICO e LATTONE perchè si forma l’ANELLO.
Quindi il BROMURO DI CIANOGENO RICONOSCE e TAGLIA la PROTEINA in corrispondenza del residuo di Met che viene LASCIATO sul LATO CARBOSSILICO del FRAMMENTO ottenuto.
Un altro metodo è con l’ACIDO O-IODOSOBENZOICO che RICONOSCE i residui di TRIPTOFANO.
Poi c’è l’IDROSSILAMMINA che TAGLIA in corrispondenza dei LEGAMI ASPARAGINA-GLICINA.
Ci sono molti AGENTI CHIMICI che possono determinare una FRAMMENTAZIONE più o meno SPECIFICA della proteina
Frammentazione con metodi enzimatici
Si utilizzano delle PROTEASI cioè degli ENZIMI che SCINDONO le PROTEINE.
Alcune proteasi sono piuttosto SPECIFICHE quindi RICONOSCONO SPECIFICI RESIDUI e TAGLIANO in corrispondenza di questi RESIDUI.
Posso tagliare in corrispondenza di DUE POSIZIONI: possono LASCIARE l’AA che viene RICONOSCIUTO o sul LATO CARBONILICO del FRAMMENTO PRODOTTO o sul LATO AMMINICO del FRAMMENTO PRODOTTO.
Gli ENZIMI più comunemente utilizzati sono la TRIPSINA che RICONOSCE residui di LISINA e ARGININA, quindi RESIDUI BASICI. Ha un pH fra 8 e 9 e lascia l’AA in corrispondenza del TERMINALE CARBONILICO del FRAMMENTO PRODOTTO.
Molto utilizzata è anche la CHIMOTRIPSINA che è SPECIFICA per degli AA AROMATICI come Phe, Trp ma anche Tyr e Leu.
La PEPSINA è un ENZIMA dello STOMACO che lavora molto bene a pH ACIDO. Quindi l’ENZIMA che si vuole utilizzare si può scegliere anche in funzione del pH al quale la PROTEINA può risultare PIU’ STABILE.
Ci sono anche l’ELASTASI, la TERMOLISINA e la TROMBINA.
Quindi ci sono varie proteasi che si possono scegliere anche in funzione delle caratteristiche della proteina e della tipologia di aa che la costituiscono
Separazione dei peptidi ottenuti
Una volta ottenuti questi FRAMMENTI, questi devono essere SEPARATI.
Per SEPARARLI si deve realizzare una CROMATOGRAFIA.
Normalmente si utilizza una CROMATOGRAFIA HPLC IN FASE INVERSA. Questo sistema è l’unico che può consentire una BUONA SEPARAZIONE di FRAMMENTI di proteine di DIMENSIONI relativamente SIMILI. La MODALITA’ MIGLIORE per SEPARARLI è quella di sfruttare la loro DIVERSA IDROFOBICITA’.
In alternativa se NON ci sono ABBASTANZA FRAMMENTI si può realizzare una SEPARAZIONE ELETTROFORETICA in quanto DOPO l’ELETTROFORESI si possono TRASFERIRE questi FRAMMENTI su una MEMBRANA che può essere una MEMBRANA DI PVDF e le PROTEINE trasferite su questa membrana possono essere DIRETTAMENTE inserite alol’interno degli APPARECCHI per il SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE.
Il vantaggio della separazione elettroforetica è quella di TRASFERIRE poi DIRETTAMENTE le PROTEINE sulla MEMBRANA, TAGLIARE la MEMBRANA con la PROTEINA che è stata trasferita sopra e utilizzarla nei sistemi per il SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE
Analisi della sequenza di ciascun peptide
Una volta separati i frammenti e raccolti singolarmente man mano che eluiscono dalla colonna, si va a fare l’ANALISI della SEQUENZA di ciascun PEPTIDE.
E’ uno STEP MOLTO DELICATO e il SEQUENZIAMENTO viene realizzato attraverso la REAZIONE DI DEGRADAZIONE DI EDMAN
Reazione di degradazione di Edman
In questa reazione come PRIMO STEP si va a CONIUGARE il FRAMMENTO della PROTEINA con una MOLECOLA che sia OTTICAMENTE RILEVABILE visto che solo quelli aromatici possono essere rilevati tramite una lettura dell’assorbimento a 280nm.
Il REAGENTE che si usa è il FENILISOCIANATO che deve essere ACCOPPIATO tramite una REAZIONE DI ACCOPPIAMENTO con il POLIPEPTIDE.
Affinché questo accoppiamento avvenga è importante che il POLIPEPTIDE presenti un GRUPPO AMMINICO NON CARICO.
Perché il GRUPPO AMMINICO abbia il DOPPIETTO ELETTRONICO DISPONIBILE le CONDIZIONI DI REAZIONE devo essere BASICHE.
La reazione di accoppiamento infatti avviene in condizioni basiche a pH 9.
E’ fondamentale che il doppietto sia DISPONIBILE perché è proprio questo che va a realizzare un ATTACCO NUCLEOFILO sul C del FENILISOTIOCIANATO. Si ha quindi la CONIUGAZIONE del POLIPEPTIDE con il FENILISOTIOCIANATO.
A questo punto avviene un RIARRANGIAMENTO di LEGAMI. Il POLIPEPTIDE viene definito PTC (feniltiocarbammilpeptide).
Il DOPPIETTO presente sull’AZOTO va a formare un DOPPIO LEGAME fra C e N e il DOPPIO LEGAME fra C e S si ROMPE e il DOPPIETTO ELETTRONICO che si LIBERA va a formare un DOPPIO LEGAME fra l’N e il C CARBONILICO del PRIMO AA del PEPTIDE.
C’è proprio una reazione di TAGLIO: il PRIMO AA si STACCA dal RESTO del polipeptide andando a formare un COMPOSTO che è un DERIVATO TIAZOLINONICO e un PTC POLIPEPTIDE che risulta essere PRIVATO dell’AA N-TERMINALE.
Questo polipeptide può essere ESTRATTO da questa REAZIONE e RITORNARE alle CONDIZIONI ALCALINE INIZIALI per REAGIRE con il FENILISOTIOCIANATO che andrà a STACCARE il NUOVO AA N-TERMINALE.
Ora le CONDIZIONI sono ACIDE dal momento che il TAGLIO di questo PRIMO AA e la costituzione del DERIVATO TIAZOLINONICO avviene in CONDIZIONI ACIDE ma queste condizioni sono anche ANIDRE cioè NON è presente ACQUA perché delle condizioni acide acquose avrebbero portato all’idrolisi del primo residuo amminoacidico ma anche all’idrolisi di tanti legami peptidici o alla frammentazione del polipeptide.
Se le CONDIZIONI DI IDROLISI ACIDA sono MOLTO SPINTE determinano la COMPLETA SEPARAZIONE di TUTTI gli AA della proteina.
Invece se sono MENO SPINTE la FRAMMENTANO comunque. In questo caso invece il RESTO del polipeptide deve rimanere INTATTO perché si deve determinare la SEQUENZA in cui sono LEGATI gli AA quindi se il polipeptide viene rotto in maniera random non si può ricostruire la sequenza.
Per cui le condizioni sono acide ma anidre, si usano dei VAPORI DI ACIDO TRIFLUOROACETICO.
In condizioni ACIDE il PEPTIDE rimanente si CARICA POSITIVAMENTE però riportandolo in CONDIZIONI ALCALINE si ottiene l’NH2 con il DOPPIETTO ELETTRONICO DISPONIBILE che può CONIUGARSI ad un’altra MOLECOLA di PTC.
Il DERIVATO TIAZOLINONICO va incontro ad una REAZIONE DI CONVERSIONE.
C’è un’IDROLISI che porta all’APERTURA dell’ANELLO, c’è la formazione di un DOPPIO LEGAME tra C e S, un altro DOPPIO LEGAME si ROMPE e diventa NH, poi c’è un C con la CATENA LATERALE LEGATA e infine un COOH.
Quindi si ha una reazione di IDROLISI e poi una reazione di CONDENSAZIONE: ENTRA una MOLECOLA D’ACQUA e poi una MOLECOLA D’ACQUA ESCE. La reazione di condensazione porta alla RICHIUSURA di una PARTE della MOLECOLA a formare l’ANELLO, ma se prima l’anello iniziava dal C legato allo S e poi coinvolgeva il resto della molecola, in questo caso l’ANELLO si forma a partire da NH con COOH.
Questo è il PRODOTTO FINALE della reazione, un PRODOTTO STABILE che prende il nome di FENILTIOIDANTOINAMMINOACIDO (PTH AA).
Il PTH AA viene poi RICONOSCIUTO dal sistema di DETECTION.
L’importanza della reazione di degradazione di Edman è il fatto che può essere RIPETUTA PIU’ VOLTE sullo STESSO POLIPEPTIDE fin quando NON viene SEQUENZIATO TUTTO quanto. Quindi si ha la formazione di un PTH AA alla volta.
Il PTH AA deve essere RICONOSCIUTO cioè bisogna capire di quale AA si TRATTA. Si possono INTRODURRE i PTH AA in una COLONNA CROMATOGRAFICA in un RP-HPLC. Si ottiene un PICCO relativo al PTH AA con uno SPECIFICO tR. E’ dal tR di questo AA che si può risalire a quale AA è perché è stata realizzata una CORSA DI STANDARD di cui si CONOSCONO i tR di tutti i PTH AA
Sequenziatore automatico di proteine
Ci sono MOLTE BOTTIGLIE che contengono i vari REATTIVI: quello per realizzare la REAZIONE DI ACCOPPIAMENTO, quello per la REAZIONE DI TAGLIO, quello per la REAZIONE DI CONVERSIONE.
All’interno del SEQUENZIATORE c’è una CAMERA DI REAZIONE che è quella in cui avviene la REAZIONE DI ACCOPPIAMENTO e DI TAGLIO.
Il PEPTIDE viene CONIUGATO con il FENILISOTIOCIANATO, si STACCA l’AA N-TERMINALE formando un DERIVATO TIOAZOLINONICO.
Poi c’è la CAMERA DI CONVERSIONE in cui il DERIVATO TIAZOLINONICO viene trasformato in PTH AA.
Poi c’è l’ANALIZZATORE DI PTH che è un sistema di RP-HPLC che è CONNESSO alla CAMERA DI CONVERSIONE.
Infine c’è il MONITOR di un computer che MOSTRA il CROMATOGRAMMA
PTH AA standard
Ogni PTH AA ha un suo SPECIFICO tR nel sistema utilizzato. Dal tR del PTH che ESCE dalla COLONNA, sulla base di questi STANDARD si risale all’AA in questione.
Per ogni PTH AA c’è il suo SPECIFICO tR e l’ALTEZZA del PICCO ottenuto in funzione delle PICOMOLI. Questo aiuta a capire QUANTE PICOMOLI di quello SPECIFICO AA si hanno mediante un CONFRONTO delle ALTEZZE del PICCO dello STANDARD e l’ALTEZZA del PICCO dell’AA
Vantaggi e svantaggi degradazione di Edman
VANTAGGI
- con poco più di 50µg di PROTEINA si può RICOSTRUIRE la SEQUENZA del PEPTIDE
- il PROCESSO è AUTOMATIZZATO
SVANTAGGI
- la QUANTITA’ di PEPTIDE che si ha a disposizione NON è MOLTO ALTA e quindi può NON essere EFFICIENTE la REAZIONE
- dopo circa 20-30 RESIDUI può cominciare a diventare DIFFICILE l’INTERPRETAZIONE dei RISULTATI dal momento che c’è un effetto di CARRY OVER ossia quando viene STACCATO il PRIMO AA si ha un PICCO poi viene STACCATO il SECONDO AA e si ha un PICCO MOLTO GRANDE relativo al SECONDO AA però rimane una PICCOLA QUANTITA’ dell’AA PRECEDENTE quindi c’è un PICCOLO PICCO relativo all’AA USCITO PRIMA. Questo si protrae per i vari cicli. Quindi quando si ARRIVA a 20-30 RESIDUI SEQUENZIATI ci sono anche i PICCHI relativi agli AA USCITI PRIMA e se il PICCO dell’AA che ESCE come PTH NON è sufficientemente ALTO potrebbe NON essere ben DISTINGUIBILE rispetto agli ALTRI PICCHI CONTAMINANTI. Quindi con questo sistema si possono SEQUENZIARE 20-30 RESIDUI anche 40 se la REAZIONE è PULITA ma NON FRAMMENTI PIU’ LUNGHI
- è necessario che l’ESTREMITA’ del PEPTIDE contenga il GRUPPO AMMINICO LIBERO, ma in alcuni peptidi naturali non è così
Blocco del gruppo NH2 terminale nelle proteine
Il GRUPPO NH2 TERMINALE delle PROTEINE potrebbe risultare BLOCCATO perché può essere presente all’N-TERMINALE un GRUPPO ACETILE (CH3-C=O) oppure un GRUPPO FORMILE (H-C=O).
Se ci sono questi GRUPPI, il DOPPIETTO ELETTRONICO indispensabile per la REAZIONE DI ACCOPPIAMENTO NON è DISPONIBILE. Di conseguenza si deve SBLOCCARE.
Lo SBLOCCO si può fare con HCl 1M in METANOLO. Viene utilizzato l’ACIDO in presenza di METANOLO, NON ACQUA PURA quindi è una SOLUZIONE ALCOLICA sempre per EVITARE che l’ACIDO possa andare a DANNEGGIARE e a ROMPERE in maniera ASPECIFICA il PEPTIDE.
Viene STACCATO il GRUPPO DI BLOCCO in maniera tale da rendere l’N-TERMINALE LIBERO. A questo punto il PEPTIDE viene portato in CONDIZIONI BASICHE in maniera tale che l’NH3+ torni ad essere NH2 e la REAZIONE può PARTIRE
