Spettrometria di massa Flashcards
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+Cos’è la spettrometria di massa?
E’ una tecnica che può essere utilizzata tanto per DETERMINARE il PM di una qualsiasi MOLECOLA, ma in particolare consente di IDENTIFICARE la MOLECOLA stessa
Cos’è uno spettrometro di massa?
E’ uno strumento che PRODUCE IONI in FASE GASSOSA e li SEPARA in base al loro RAPPORTO MASSA/CARICA (m/z).
Molto spesso gli IONI che vengono PRODOTTI possiedono una SOLA CARICA, quindi z corrisponde a 1 e di conseguenza il RAPPORTO MASSA/CARICA coincide con la MASSA MOLECOLARE della SPECIE IONICA
Schema di uno spettrometro di massa
Uno spettrometro di massa è costituito da una SORGENTE che è la CAMERA DI IONIZZAZIONE dove vengono prodotti gli IONI in FASE GASSOSA.
A MONTE della SORGENTE c’è una SISTEMA per l’INTRODUZIONE del CAMPIONE all’interno della CAMERA.
Dopo la sorgente c’è un ANALIZZATORE che è la parte dello strumento nella quale i VARI IONI PRODOTTI vengono SEPARATI in funzione del RAPPORTO MASSA/CARICA.
Poi c’è un RIVELATORE che serve per RIVELARE gli IONI man mano che è raggiunto dagli IONI stessi.
Il SISTEMA è in COLLEGAMENTO con un SOFTWARE che consente di ELABORARE i DATI e di VISUALIZZARE l’OUTPUT come uno SPETTRO DI MASSA.
La parte dello strumento che include il sistema di introduzione del campione, la sorgente, l’analizzatore e il rivelatore è normalmente SOTTOVUOTO. Il VUOTO è importante per IMPEDIRE che gli IONI in FASE GASSOSA prodotti possano URTARE con i GAS ATMOSFERICI e questo potrebbe portare ad un’eventuale PERDITA di IONIZZAZIONE e una VARIAZIONE DELL’ENERGIA CINETICA
Introduzione del campione
Il CAMPIONE può essere introdotto allo STATO SOLIDO, LIQUIDO o GASSOSO.
All’inizio dello sviluppo di questa tecnica il campione poteva essere introdotto solo allo stato gassoso, invece successivamente ci sono state delle implementazioni che hanno consentito l’introduzione del campione allo stato liquido che deve essere comunque portato ad una fase vapore o deve essere nebulizzato in maniera tale da poter essere analizzato.
Il campione può essere introdotto anche allo stato solido utilizzando una sonda.
C’è tutto un sistema di VALVOLE che permettono di ACCEDERE alla CAMERA DI IONIZZAZIONE senza che questa venga a contatto con l’esterno dato che è sottovuoto.
La spettrometria è una tecnica abbastanza SENSIBILE. La QUANTITA’ di MATERIALE necessario è nell’ordine dei µg-ng.
E’ possibile COLLEGARE lo SPETTROMETRO DI MASSA a dei SISTEMI CROMATOGRAFICI (es. gas-cromatografia, HPLC) in quanto i CAMPIONI che vengono SEPARATI attraverso il SISTEMA CROMATOGRAFICO possono essere introdotti nello SPETTROMETRO DI MASSA per essere IDENTIFICATI.
Queste TECNICHE vengono denominate come GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) oppure LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry)
Tecniche di ionizzazione
La prima fase di un’analisi di spettrometria di massa è quella di produrre degli IONI in FASE GASSOSA. Quindi ci sono una serie di tecniche di ionizzazione utilizzate per lo scopo.
Queste tecniche di ionizzazione si distinguono in DUE CATEGORIE
- TECNICHE HARD: operano ad un’ELEVATA ENERGIA e quindi portano ad una FRAMMENTAZIONE anche importante del campione. C’è una tecnica di ionizzazione hard che è l’IMPATTO ELETTRONICO
- TECNICHE SOFT: operano ad un’ENERGIA PIU’ BASSA e producono una MINORE FRAMMENTAZIONE del CAMPIONE
A seconda della tecnica di ionizzazione ci sono dei METODI di VOLATILIZZAZIONE del CAMPIONE che sono diversi.
Per quanto riguarda la IONIZZAZIONE ELETTRONICA (EI, tecnica HARD) e la IONIZZAZIONE CHIMICA (CI, tecnica SOFT), il CAMPIONE deve essere VAPORIZZATO quindi trasformato in fase vapore. Questi tipi di ionizzazione possono essere ADATTI solo a MOLECOLE PICCOLE, NON TERMOLABILI e VOLATILI. Sono adatti per lo più a MOLECOLE ORGANICHE (molecole aromatiche, idrocarburi, molecole con lunghe catene alifatiche).
Altre tecniche di ionizzazione SOFT sono la IONIZZAZIONE PER ELETTRONEBULIZZAZIONE (ESI, electronspray ionization) nella quale il CAMPIONE viene NEBULIZZATO.
Poi ci sono altre DUE TECNICHE, il BOMBARDAMENTO CON ATOMI VELOCI (FAB) e la IONIZZAZIONE LASER ASSISTITA DA MATRICE (MALDI) per le quali il metodo di VOLATILIZZAZIONE si basa sul DESORBIMENTO del CAMPIONE da una SONDA.
Sono i sistemi in cui il CAMPIONE può essere introdotto nel sistema in FASE SOLIDA utilizzando una SONDA.
Questi tipi di ionizzazione visto che non necessitano la trasformazione del campione in fase vapore sono ADATTI a MOLECOLE GRANDI, TERMOLABILI perché le temperature che vengono raggiunte non sono così elevate, e NON VOLATILI
Ionizzazione elettronica
Questo tipo di ionizzazione si basa su un IMPATTO di ELETTRONI ACCELERATI sulla MOLECOLA.
Un FILAMENTO DI TUNGSTENO INCANDESCENTE EMETTE un FASCIO DI ELETTRONI i quali vengono ACCELERATI verso un ANODO che è posto alla parte OPPOSTA del FILAMENTO. Durante questa fase di ACCELERAZIONE gli ELETTRONI ACQUISTANO un’ELEVATA ENERGIA.
L’ENERGIA del FASCIO è fissata a 70 eV.
La MOLECOLA che viene COLPITA da questo FASCIO DI ELETTRONI viene IONIZZATA nel senso che questi elettroni incidenti determinano l’emissione degli elettroni del guscio più esterno. In questa maniera si forma un RADICAL CATIONE perché è una MOLECOLA NEUTRA a cui è stata SOTTRATTO un ELETTRONE, di conseguenza è una MOLECOLA RADICALICA CARICA POSITIVAMENTE.
Questi RADICAL CATIONI sono RESPINTI da un REPELLER che è CARICO POSITIVAMENTE (ha la STESSA CARICA del CATIONE che si forma), ma sono ATTRATTI attraversi una serie di PIASTRE ACCELERATRICI CARICHE NEGATIVAMENTE che hanno anche dei POTENZIALI PROGRESSIVAMENTE CRESCENTI. Quindi sono TRASCINATI verso queste PIASTRE ACCELERATRICI.
Le PIASTRE ACCELERATRICI sono IN SERIE l’una rispetto all’altra e con un POTENZIALE PROGRESSIVAMENTE CRESCENTE e ATTIRANO i RADICAL CATIONI.
Dalle piastre vengono introdotti nell’ANALIZZATORE che è la parte dello strumento successiva alla sorgente quindi alla CAMERA DI IONIZZAZIONE
Ionizzazione-frammentazione
La ionizzazione elettronica è una TECNICA DI IONIZZAZIONE HARD che opera ad ENERGIE ELEVATE.
La MOLECOLA NEUTRA M nel momento in cui viene BOMBARDATA dal FASCIO ELETTRONICO viene favorita l’EMISSIONE, la fuoriuscita degli elettroni dal guscio più esterno. Di conseguenza si formano dei RADICAL CATIONI M+∙.
Questi RADICAL CATIONI sono prodotti ad un’ENERGIA MOLTO ELEVATA dal momento che il FASCIO DI ELETTRONI che colpisce questa molecola ha un’ENERGIA di 70 eV.
L’ENERGIA necessaria per IONIZZARE una MOLECOLA ORGANICA è di circa 13-14 eV quindi il FASCIO ha un’ENERGIA MOLTO MAGGIORE rispetto a quella NECESSARIA alla FORMAZIONE del RADICAL CATIONE. Quindi l’ECCESSO DI ENERGIA viene poi LIBERATO con la FRAMMENTAZIONE della MOLECOLA.
Di conseguenza da questa molecola si PRODURRANNO anche delle SPECIE NEUTRE e dei CATIONI. Alcune di queste specie possono essere analizzate dallo spettrometro mentre altre no.
Le SPECIE che NON si possono ANALIZZARE sono i RADICALI NEUTRI dal momento che lo STRUMENTO NON è in grado di RILEVARE una MOLECOLA che NON abbia CARICA dal momento che solo quelle CARICHE POSITIVAMENTE vengono ATTRATTE verso le PIASTRE ACCELERATRICI che sono CARICHE NEGATIVAMENTE.
La molecola viene colpita dal fascio elettronico e questo determina l’espulsione di un elettrone del guscio esterno in modo tale da formare un radical catione. Questo è anche definito IONE MOLECOLARE dal momento che la MOLECOLA è INTATTA a meno della PERDITA di un ELETTRONE e la MASSA di questa molecola corrisponde alla MASSA della MOLECOLA ORIGINARIA dal momento che il PESO di un ELETTRONE viene considerato ININFLUENTE sulla MASSA MOLECOLARE.
Tuttavia proprio per l’ENERGIA ACCUMULATA da questa MOLECOLA essa può FRAMMENTARSI.
Dal RADICAL CATIONE si possono FORMARE SPECIE DIVERSE, per esempio si può formare una specie radicalica + una specie cationica.
Ci sono varie modalità di frammentazione della molecola, si possono ROMPERE LEGAMI CHIMICI in PIU’ PUNTI.
Le uniche molecole che potranno essere ANALIZZATE nell’ANALIZZATORE saranno quelle CARICHE POSITIVAMENTE quindi i CATIONI e il RADICAL CATIONE
Esempio: processo di ionizzazione dell’n-decano
Il processo di ionizzazione porta allo ione molecolare con m/z 142 (z=1). Si può avere un’ulteriore frammentazione con perdita di specie neutre che non vengono riconosciute dallo strumento e formazione di ioni che vengono definiti ioni frammento.
Quindi c’è lo ione molecolare che è la molecola a cui è stato sottratto l’elettrone e una serie di ioni frammento che avranno dei rapporti m/z differenti dal momento che mancano di alcune parti della molecola.
Le particelle neutre sono allontanate dalla pompa a vuoto mentre le particelle cariche sono convogliate nell’analizzatore.
In output si ha uni spettro di massa che ha dei picchi corrispondono al rapporto massa/carica di tutti gli ioni identificati.
Ogni molecola ha un pattern di frammentazione caratteristico ed è proprio da questo che si può risalire all’identità della molecola. Ci sono dei database che conservano tutte le informazioni relative alle possibili frammentazioni a cui può andare incontro una qualsiasi molecola.
Quindi utilizzando questi database e sulla base dell’output ricevuto dallo strumento si può risalire in base al pattern di frammentazione alla tipologia della molecola che è stata analizzata
Spettro di massa
Sulla base dello spettro viene identificato il PICCO che ha l’ALTEZZA MAGGIORE che QUASI MAI corrisponde al PICCO dello IONE MOLECOLARE.
Di norma il PICCO BASE è dello IONE FRAMMENTO a meno che la frammentazione non sia stata talmente soft da lasciare una grande quantità di ione molecolare che può essere visto come un picco molto alto. Ciò non accade mai perché la frammentazione è abbastanza spinta.
Quindi viene identificato il picco più alto che di norma corrisponde allo ione frammento e che viene definito picco base.
A questo punto si attribuisce un’ABBONDANZA pari a 180. Per quanto riguarda gli ALTRI PICCHI viene definita un’ABBONDANZA RELATIVA rispetto al 100 che è il PICCO PIU’ ALTO.
La prima cosa che si fa quando si ottiene un OUTPUT è IDENTIFICARE lo IONE MOLECOLARE che può anche essere un PICCO ABBASTANZA PICCOLO. Lo IONE MOLECOLARE dà la possibilità di DEFINIRE la MASSA della MOLECOLA INTATTA.
Poi si IDENTIFICANO gli IONI FRAMMENTO. Sfruttando i DATABASE si possono IDENTIFICARE i processi di FRAMMENTAZIONE CARATTERISTICI delle varie molecole e cercare per confronto di individuare DA QUALE MOLECOLA possono essere stati PRODOTTI gli IONI FRAMMENTO identificati.
Si ricostituisce in questa maniera la STRUTTURA della MOLECOLA.
Il PICCO dello IONE MOLECOLARE può essere POCO INTENSO e talvolta addirittura ASSENTE se la MOLECOLA si FRAMMENTA molto FACILMENTE.
In genere, si osserva una GRADUATORIA DI COMPLESSIVITA’ per i COMPOSTI ORGANICI: i COMPOSTI AROMATICI e le OLEFINE CONIUGATE danno PICCHI MOLTO INTENSI, ci sono PICCHI POCO INTENSI con CHETONI, AMMINE, ESTERI e PICCHI QUASI ASSENTI con MOLECOLE RAMIFICATI e ALCOLI TERZIARI
Spettro di massa semplice (spettro dell’aria)
Si riconoscono delle MASSE MOLECOLARI dell’ACQUA (18), dell’AZOTO (28), dell’OSSIGENO (32), dell’ANIDRIDE CARBONICA (44).
E’ abbastanza semplice riconoscere le masse di queste molecole. Ci sono dei NUMERI di MASSA DIFFERENTI come 16 e 17. Per esempio, 17 può essere il gruppo OH, 16 è l’ossigeno.
Il rapporto m/z 29 è determinato dalla presenza di ISOTOPI dell’AZOTO, invece di essere un azoto 14 , è un AZOTO 14+15.
Quindi utilizzando dei database grazie ai pattern di frammentazione si riesce a identificare la molecola in questione
Caratteristiche della ionizzazione elettronica
E’ una ionizzazione HARD quindi si possono avere delle FRAMMENTAZIONI ESTESE che lasciano QUASI INIDENTIFICABILE lo IONE MOLECOLARE.
Il CAMPIONE deve essere portato allo STATO DI VAPORE.
E’ ADATTO per COMPOSTI VOLATILI che NON siano TERMOLABILI e di norma PICCOLI con MASSE MOLECOLARI INFERIORI a 800 Da.
Questo tipo di ionizzazione si può INTERFACCIARE con dei GAS CROMATOGRAFI o degli HPLC
Ionizzazione chimica
Consiste nel TRASFERIMENTO di un PROTONE H+ da un GAS REAGENTE (G) alla MOLECOLA NEUTRA (M) che si deve ANALIZZARE per formare uno IONE MOLECOLARE PROTONATO, quindi è uno ione molecolare a cui è stato donato un protone.
In questo caso la sua MASSA sarà effettivamente M+1 dal momento che bisogna considerare la MASSA del PROTONE e AGGIUNGERLA alla MASSA della MOLECOLA.
Quello che si registra è una MASSA pari a M+1, quindi per definire la MASSA della MOLECOLA bisogna SOTTRARRE un’UNITA’, mentre z è sempre 1. Quindi il rapporto m/z dà sempre M+1
- Nella CAMERA DI IONIZZAZIONE sono presenti la MOLECOLA da analizzare allo STATO GASSOSO, deve essere portata ad uno stato di VAPORE, e un GAS REAGENTE. Questo gas reagente è soggetto a IONIZZAZIONE ELETTRONICA che permette la formazione di RADICAL CATIONI del GAS REAGENTE
- Il RADICAL CATIONE va a REAGIRE con le MOLECOLE di GAS NEUTRE che NON sono state IONIZZATE. A queste si va a sottrarre un ATOMO DI IDROGENO formando degli IONI PROTONATI, IONI GAS REAGENTE PROTONATO GH+
- A questo punto questo GAS REAGENTE PROTONATO va a REAGIRE come ACIDO, cioè come specie in grado di cedere un protone e lo TRASFERISCE alla MOLECOLA che si vuole analizzare in maniera tale da formare uno IONE MOLECOLARE PROTONATO
Esempio: prendendo in considerazione il metano, il gas reagente deve essere previamente ionizzato quindi sottoposto ad un processo di ionizzazione elettronica
Si forma il radical catione.
Questo radical catione può andare a reagire con delle molecole di gas neutre e va a sottrarre un atomo di H formando un gas reagente protonato (CH4 diventa CH5+).
A questo punto il CH5+ può andare a cedere un protone alla molecola in questione. Il CH4 per ionizzazione elettronica diventa un radical catione. Eventualmente c’è la possibilità che il radical catione si frammenti ulteriormente quindi che si formi il radical catione CH3+∙.
Il radical catione nella seconda fase della ionizzazione va a reagire con molecole di gas neutre formando il CH5+ e il CH3∙.
C’è anche la possibilità che la reazione del radical catione con le molecole neutre possa dare anche degli ioni molecolari protonati di natura diversa. Per esempio, si può formare il C2H5+ con rilascio di idrogeno molecolare e di un atomo di idrogeno.
Questo C2H5+ è anch’esso reattivo e può reagire con molecole di gas neutre formando C3H5+ e due molecole di idrogeno. Fra tutti questi l’acido più forte è il CH5+ e sarà poi questo che andrà a cedere un protone alla molecola da analizzare. Il CH5+ reagisce con la molecola. Si forma una molecola protonata e di nuovo si ha la formazione di CH4. La massa della molecola sarà M+1.
Risultato di un’analisi di spettrometria di massa di una molecola generica M: c’è un picco molto elevato relativo alla molecola protonata dal momento che questo tipo di ionizzazione è soft e talvolta non porta a delle ionizzazioni troppo spinte quindi si può vedere un bel picco relativo alla molecola intatta. Si possono vedere altri segnali che possono essere relativi a degli addotti della molecola con le altre specie che si sono formate nel corso della ionizzazione chimica (C2H5+ e C3H5+). Ci sono anche dei picchi relativi alla massa della molecola +15, alla massa della molecola +29
Altri gas reagenti
L’AFFINITA’ PROTONICA è la FORZA con cui le MOLECOLE TRATTENGONO il PROTONE. Un’ELEVATA AFFINITA’ PROTONICA come quella dell’ammoniaca e del corrispondente acido che è l’ammonio quaternario, significa che l’ammonio tende a CEDERE PIU’ DIFFICILMENTE un PROTONE rispetto a un metano protonato che ha un’AFFINITA’ PROTONICA MINORE.
Di conseguenza anche l’ENERGIA che questi ACIDI sono in grado di TRASFERIRE alla MOLECOLA quando la PROTONANO è DIVERSA dal momento che l’energia che viene trasferita dal CH5+ sarà maggiore rispetto al CH3OH2+ e questo trasferirirà un’energia maggiore rispetto all’NH4+ perché se l’NH4+ è quello che trattiene maggiormente il protone rispetto alle altre specie lo trasferirà ad un’energia minore cioè la MOLECOLA in questione si FRAMMENTERA’ di MENO rispetto a quanto possa frammentarsi se si utilizzasse il CH5+ come gas reagente
Scelta del gas reagente
Spettro della malonammide di pentobarbital con massa molecolare 200 ionizzata utilizzando come gas reagente il metano o l’ammonio.
La frammentazione ottenuta con il metano è maggiore.
La massa dello ione molecolare deve essere ricercata come 201 perché è M+1 e c’è il relativo picco. Ci sono una serie di picchi relativi alla frammentazione.
Il picco relativo alla molecola è decisamente molto più alto nella frammentazione ottenuta con ammonio dal momento che l’energia ceduta dall’NH4+ alla molecola è molto più bassa e non consente una grande frammentazione
Confronto tra EI e CI: efedrina
Con la EI non c’è la presenza del radical catione mentre c’è un picco molto alto al rapporto m/z 58 che deriva dalla rottura della molecola.
Per quanto riguarda la CI, c’è un picco M+1166 relativo alla molecola protonata, poi ci sono altri picchi 148 che è derivato dalla rottura di un legame C-O e poi un picco a 58. Il pattern di frammentazione è più complesso.
Se si vuole identificare la natura della molecola con uno spettro di frammentazione di questo tipo si è agevolati dal momento che oltre ad avere il picco che indica la massa della molecola ci sono anche dei picchi di frammentazione che derivano dalla rottura di specifici legami.
In genere la CI dà dei FRAMMENTI PIU’ SIGNIFICATIVI della EI.
Mentre con la EI c’è la possibilità di ROMPERE anche i LEGAMI C-C, con la CI questi LEGAMI tendono a ROMPERSI MENO FACILMENTE perché NON c’è un’ENERGIA SUFFICIENTE che possa portare alla ROTTURA di questi LEGAMI.
Il TAGLIO è per lo più limitato nella CI a LEGAMI C-O, C-S e C-N.
Per cui la CI è ADATTA a molecole come IDROCARBURI, ALCOLI, ESTERI che in condizioni di EI darebbero una FRAMMENTAZIONE ECCESSIVA che potrebbe rendere DIFFICILE l’IDENTIFICAZIONE della molecola in questione
Caratteristiche della CI
E’ una ionizzazione SOFT. Lo IONE MOLECOLARE è SEMPRE PRESENTE quindi ci sono INFORMAZIONI sul PM.
Ha una MINORE FRAMMENTAZIONE rispetto alla EI. Si hanno SCARSE INFORMAZIONI sulla STRUTTURA se la IONIZZAZIONE produce SOLO lo IONE MOLECOLARE ma NON gli IONI FRAMMENTO. Se c’è anche la produzione di IONI FRAMMENTO questo aiuta nell’IDENTIFICAZIONE di una molecola.
Il CAMPIONE deve essere in STATO DI VAPORE.
E’ ADATTA per COMPOSTI PICCOLI, NON TERMOLABILI e VOLATILI.
Può INTERFACCIARSI con degli HPLC
Elettrospray (ESI)
E’ l’unico sistema che consente di INTRODURRE il CAMPIONE nella CAMERA DI IONIZZAZIONE a PRESSIONE ATMOSFERICA.
Il sistema di VOLATILIZZAZIONE del campione è una NEBULIZZAZIONE.
La NEBULIZZAZIONE si adatta a MOLECOLE GRANDI, TERMOLABILI come per esempio le proteine. Quindi è un sistema ampiamente utilizzato per l’analisi di proteine in spettrometria di massa.
Il CAMPIONE viene inserito all’interno di un CAPILLARE e un GAS INERTE, in genere azoto, viene utilizzato per determinare il processo di NEBULIZZAZIONE del campione.
Il CAMPIONE viene SOLUBILIZZATO all’interno di una SOLUZIONE ACIDA o BASICA, a seconda delle necessità, che rispettivamente consentono di formare degli IONI POSITIVI o NEGATIVI.
Al TERMINALE del CAPILLARE viene ATTRIBUITO un POTENZIALE POSITIVO o NEGATIVO a seconda della NATURA degli IONI PRODOTTI.
Se vengono PRODOTTI degli IONI MOLECOLARI POSITIVI il TERMINALE del CAPILLARE risulta costituire il CATODO di un CIRCUITO ELETTRICO a cui è applicata una D.D.P. di circa 5kV rispetto al CONTROELETTRODO
Nebulizzazione
Avviene con l’aiuto del GAS INERTE.
In genere per l’ANALISI DI PEPTIDI e PROTEINE si usa sempre la IONIZZAZIONE POSITIVA quindi significa che vengono prodotti degli ioni molecolari carichi positivamente. La CARICA POSITIVA dei PEPTIDI è dovuta alla PROTONAZIONE di UNO o PIU’ GRUPPI FUNZIONALI BASICI (es. lisine).
Si SOLUBILIZZA il CAMPIONE in una SOLUZIONE ACIDA, si ha la formazione di IONI MOLECOLARI CARICHI POSITIVAMENTE e si inserisce il CAMPIONE all’interno del CAPILLARE. In questo caso il TERMINALE del CAPILLARE costituirà l’ANODO del CIRCUITO ELETTRICO. Questo terminale del capillare avrà un POTENZIALE POSITIVO, di conseguenza si viene a determinare una REPULSIONE fra le CARICHE POSITIVE dell’ANALITA che sono presenti all’interno del campione e il TERMINALE del capillare. Queste CARICHE POSITIVE risultano essere FORTEMENTE ATTRATTE dal CONTROELETTRODO. Fra i DUE ELETTRODI vi è una D.D.P. MOLTO ELEVATA per cui queste CARICHE POSITIVE sono portate a seguire il campo elettrico e a spostarsi verso l’ELETTRODO CARICO NEGATIVAMENTE.
Gli IONI POSITIVI progressivamente tendono ad ALLONTANARSI dal CAPILLARE ATTRATTI dal CONTROELETTRODO mentre eventuali IONI NEGATIVI presenti vengono TRATTENUTI all’interno del CAPILLARE.
Il LIQUIDO che progressivamente si ALLUNGA, si ESPANDE formando una sorta di CONO. Il cono prende il nome di CONO DI TAYLOR e la PUNTA del cono che è la PARTE MENO STABILE si ALLUNGA progressivamente formando un GETTO SOTTILE che si SCINDE in una miriade di SINGOLE GOCCIOLINE CARICHE
Evaporazione del solvente
Si forma questo FASCIO di GOCCIOLINE NEBULIZZATE che sono CARICHE POSITIVAMENTE dal momento che contengono gli IONI POSITIVI del campione. Queste sono ATTRATTE da un CONTROELETTRODO CARICO NEGATIVAMENTE e nel percorso terminale del capillare verso il controelettrodo viene INIETTATO un GAS AUSILIARIO INERTE, di norma azoto, RISCALDATO in maniera tale da FAVORIRE la progressiva EVAPORAZIONE DEL SOLVENTE.
La GOCCIOLINA all’inizio era GRANDE e contenente delle SPECIE CARICHE POSITIVAMENTE. Man mano che queste GOCCIOLINE si SPOSTANO verso il CONTROELETTRODO si RIMPICCIOLISCONO dal momento che il GAS è RISCALDATO e determina l’EVAPORAZIONE DEL SOLVENTE.
La REPULSIONE fra le CARICHE POSITIVE all’interno della GOCCIOLINA diventa tale per cui la GOCCIOLINA ESPLODE e si formano delle PARTICELLE di MINORI DIMENSIONI. Questo processo di FRAMMENTAZIONE si RIPETE più volte fino alla COMPLETA EVAPORAZIONE DEL SOLVENTE e la formazione di una popolazione di IONI POSITIVI SINGOLI che NON sono SOLVATATI. Il SOLVENTE è EVAPORATO COMPLETAMENTE e sono stati PRODOTTI solo IONI MOLECOLARI CARICHI POSITIVAMENTE.
Questi ioni carichi positivamente vengono indirizzati da un GRADIENTE DI CAMPO ELETTRICO verso l’ANALIZZATORE. Si muovono ATTRATTI da un CONTROELETTRODO CARICO NEGATIVAMENTE nell’ANALIZZATORE e verranno SEPARATI in funzione del RAPPORTO m/z
Specie multicarica
Una caratteristica peculiare del sistema è che può PRODURRE delle SPECIE MULTICARICA dal momento che le CARICHE POSITIVE dei peptidi sono dovute alla PROTONAZIONE dei GRUPPI FUNZIONALI BASICI. Ce ne possono essere molti quindi tutti o una parte di essi possono essere soggetti alla protonazione. Di conseguenza la STESSA MOLECOLA può avere STATI DI PROTONAZIONE DIFFERENTI. Si possono avere da 10 a 22 PROTONI. Ci possono essere SITUAZIONI INTERMEDIE in cui la STESSA MOLECOLA è PROTONATA in maniera DIFFERENTE.
Questa formazione di SPECIE MULTICARICA dà la possibilità di ANALIZZARE per spettrometria di massa delle MOLECOLE ad ELEVATISSIMO PM in quanto possono rientrare nell’INTERVALLO DI MASSA RILEVABILE dalla maggior parte degli ANALIZZATORI esistenti perché quello che viene rivelato è il RAPPORTO m/z quindi anche se la MASSA è MOLTO GRANDE il RAPPORTO m/z potrebbe risultare PICCOLO per il fatto che z NON è pari a 1 ma ad un NUMERO che può essere abbastanza GRANDE.
Gli SPETTRI DI MASSA di SPECIE MULTICARICA sono molto PIU’ COMPLESSI. Per questo si realizza tramite dei software una DECONVOLUZIONE dello SPETTRO in maniera tale da ELIMINARE la MAGGIOR PARTE dei PICCHI relativi alle SPECIE MULTICARICA e RISALIRE solo al PICCO MOLECOLARE
Caratteristiche ESI
- E’ un processo a PRESSIONE ATMOSFERICA e come tale è un metodo più semplice che può essere ACCOPPIATO molto bene con INTERFACCE HPLC
- E’ il metodo di scelta per l’ANALISI di MOLECOLE TERMOLABILI. Può essere utilizzato per l’analisi di molecole di grandi dimensioni (peptidi, carboidrati, DNA)
- Il CAMPIONE deve essere SOLUBILE perché deve essere SOLUBILIZZATO in SOLUZIONE ACIDE o BASICHE, in genere acide per favorire la formazione di ioni positivi. Deve essere POLARE e PURO (libero da sali, detergenti)
- Il sistema è l’UNICO che produce degli IONI MULTICARICA
Ionizzazione per desorbimento: FAB e MALDI
La MOLECOLA viene EVAPORATA da una SUPERFICIE e CONTEMPORANEAMENTE IONIZZATA.
Questo DESORBIMENTO può avvenire con il BOMBARDAMENTO CON ATOMI AD ALTA ENERGIA (FAB) o tramite l’INVIO DI FOTONI (MALDI)
FAB: FAST ATOM BOMBARDMENT
Il CAMPIONE viene MISCELATO con una MATRICE ORGANICA LIQUIDA ma altamente VISCOSA e POCO VOLATILE.
Di norma si utilizza il GLICEROLO, il TIOGLICEROLO, la DIETILAMMINA ecc.
La SOLUZIONE è importante che sia altamente VISCOSA e POCO VOLATILE in maniera tale da FAVORIRE solo la VOLATILIZZAZIONE del CAMPIONE in seguito al BOMBARDAMENTO con gli ATOMI VELOCI anche se una PICCOLA QUANTITA’ di MOLECOLE di MATRICE saranno VOLATILIZZATE.
Questa MISCELA ANALTA-MATRICE viene posta su una SONDA che viene INTRODOTTA nella CAMERA DI IONIZZAZIONE. Si ha un BOMBARDAMENTO di questa MISCELA ANALITA-MATRICE con un FASCIO DI ATOMI molto VELOCI.
Gli ATOMI IMPATTANDO con la SUPERFICIE determinano un INNALZAMENTO della TEMPERATURA che avviene per un PERIODO TROPPO BREVE per determinare la ROTTURA dei LEGAMI CHIMICI, ma un TEMPO sufficientemente LUNGO da permettere la IONIZZAZIONE del CAMPIONE e il DESORBIMENTO.
In seguito all’IMPATTO di questi ATOMI VELOCI con la MATRICE, si determina la formazione di SPECIE CARICHE POSITIVAMENTE, di SPECIE CARICHE NEGATIVAMENTE e il DESORBIMENTO delle MOLECOLE della MATRICE.
Le SPECIE CARICHE POSITIVAMENTE vengono ATTRATTE da PIASTRE A POTENZIALE NEGATIVO che indirizzano questi IONI POSITIVI verso l’ANALIZZATORE che SEPARA gli IONI in base al RAPPORTO m/z.
Si ha quindi un RAGGIO DI ATOMI VELOCI che va a IMPATTARE con la SOLUZIONE ANALITA-MATRICE. In questo processo la MATRICE va a CEDERE o SOTTRARRE un PROTONE al CAMPIONE.
Quindi si formano SPECIE PROTONATE CARICHE POSITIVAMENTE o SPECIE DEPROTONATE CARICHE NEGATIVAMENTE. Quindi si formano IONI MOLECOLARI POSITIVI o NEGATIVI MOLTO STABILI, NON hanno una grande tendenza a FRAMMENTARSI ulteriormente dal momento che l’ENERGIA dalla quale vengono FORMATI NON è particolarmente ELEVATA.
Questi IONI DIFFERISCONO dal CAMPIONE ORIGINALE solo per UNA UNITA’ DI MASSA quindi z risulta essere pari a 1.
Possono essere DESORBITE anche delle MOLECOLE della MATRICE. Oppure possono essere DESORBITE anche SPECIE NEUTRE NON CARICHE.
Si seguono solo le SPECIE che hanno la IONIZZAZIONE DI INTERESSE, di solito gli IONI MOLECOLARI POSITIVI che vengono ACCELERATI verso delle PIASTRE A POTENZIALE NEGATIVE e poi entrano nell’ANALIZZATORE.
Il FASCIO DI ATOMI VELOCI viene prodotto all’interno di un ATOM GUN cioè un CANNONE ATOMICO nel quale viene inserito un GAS, di norma dei GAS NOBILI (argon, xeno) che viene IONIZZATO attraverso una IONIZZAZIONE ELETTRONICA. Si ha la formazione di RADICAL CATIONI.
Questi IONI CARICHI POSITIVAMENTE vengono ACCELERATI in quanto vengono ATTRATTI verso un POLO CARICO NEGATIVAMENTE e vengono convogliati in una CAMERA DI COLLISIONE in cui è presente ARGON o XENO GASSOSO. Per cui all’interno di questa camera di collisione che ha una CONCENTRAZIONE MOLTO ELEVATA di GAS, questi IONI che entrano ad ELEVATA VELOCITA’ vanno ad URTARE contro gli ATOMI NEUTRI dello stesso GAS, CEDONO la loro ENERGIA CINETICA e vanno a generare un FLUSSO DI ATOMI NEUTRI che ESCONO dalla CAMERA DI COLLISIONE ad ELEVATA VELOCITA’ e vanno ad IMPATTARE sul CAMPIONE.
A questo punto l’ANALITA viene DESORBITO e gli IONI POSITIVI vengono INDIRIZZATI verso l’ANALIZZATORE.
Da questa camera di collisione vengono SELEZIONATI solo ed esclusivamente degli atomi NEUTRI dal momento che al TERMINE di questa CAMERA DI COLLISIONE è applicato un POTENZIALE POSITIVO che ha la funzione di RESPINGERE gli IONI POSITIVI.
Quindi gli IONI POSITIVI rimangono all’interno del CANNONE ATOMICO e solo quelli NEUTRI ACCELERATI possono USCIRE e andare a COLPIRE il CAMPIONE posto sulla SONDA
