Frazionamento Flashcards
(10 cards)
Metodi di frazionamento in funzione della solubilità
Il FRAZIONAMENTO è una delle prime applicate al termine dell’estrazione totale delle proteine.
Il frazionamento è una sorta di PRECIPITAZIONE FRAZIONATA che serve per ARRICCHIRE la FRAZIONE RECUPERATA della PROTEINA DI INTERESSE e viene realizzata sfruttando la SOLUBILITA’ della proteina.
Le proteine che sono solubili all’interno del citoplasma sono delle proteine globulari che hanno una struttura tridimensionale dove i residui polari anche carichi tendono a disporsi sulla superficie della proteina mentre quelli non polari tendono a disporsi nel core idrofobico dal momento che sono più lontani dall’ambiente polare acquoso in cui la proteina è solubilizzata.
Alcuni residui idrofobici della configurazione tridimensionale della proteina tenderanno ad essere parzialmente esposti al solvente.
Nel momento in cui una proteina viene solubilizzata all’interno di un solvente polare, delle molecole di acqua di questo solvente tenderanno a solvatare la proteina e alcune si disporranno in maniera ordinata a solvatare le regioni idrofobiche
Frazionamento con sali
Nel momento in cui si aggiunge un SALE, si AUMENTA la CONCENTRAZIONE SALINA (forza ionica) della soluzione quindi le MOLECOLE D’ACQUA che sono all’interno del SOLVENTE tendono a SOLVATARE gli IONI presenti nella soluzione abbandonando le regioni idrofobiche.
Questo comporta che le REGIONI IDROFOBICHE rimangono SCOPERTE e per EFFETTO IDROFOBICO queste regioni tendono ad AGGREGARSI in maniera tale da sottrarre la PORZIONE IDROFOBICA dal CONTATTO con l’ACQUA.
Questa AGGREGAZIONE porta alla PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE, il SALTING OUT cioè è la FUORIUSCITA delle PROTEINE da una SOLUZIONE SALINA quando la CONCENTRAZIONE DI SALE AUMENTA.
Il SALTING IN invece è la presenza di una BASSA CONCENTRAZIONE SALINA nella soluzione che favorisce la SOLUBILITA’ di una PROTEINA
di Grafico: solubilità della proteina in funzione della concentrazione salina
Quando la CONCENTRAZIONE SALINA è estremamente BASSA la solubilità della proteina non è molto alta perché in condizioni normali le proteine tendono ad ATTRARSI tra di loro per le FORZE DI ATTRAZIONE tra CARICHE OPPOSTE degli aa basici e acidi (sulla superficie).
Le proteine si AGGREGANO e questo favorisce la loro PRECIPITAZIONE.
Se si AUMENTA un po’ la CONCENTRAZIONE SALINA si favorisce la SOLUBILITA’ delle proteine perché gli IONI del sale vanno ad interagire con le CARICHE ELETTRICHE neutralizzandole e impediscono alle proteine di formare AGGREGATI.
Se si AUMENTA TROPPO la CONCENTRAZIONE SALINA le PROTEINE tendono ad USCIRE dalla SOLUZIONE causando il SALTING OUT.
L’acqua abbandona le molecole proteiche che precipitano per andare a solvatare gli ioni.
Le PROTEINE PRECIPITATE devono essere riportate in SOLUZIONE: il SALTING OUT NON determina la PERDITA TOTALE della CONFORMAZIONE TRIDIMENSIONALE per cui se le PROTEINE si riportano ad una CONCENTRAZIONE SALINA PIU’ BASSA la RIACQUISTANO e possono essere riportate in SOLUZIONE.
Il salting out può essere considerato un fenomeno reversibile
Calcolo della forza ionica (I)
Quantità di IONI presenti in una soluzione.
Se una proteina precipita a una forza ionica minore rispetto ad un’altra significa che è maggiormente idrofobica.
Quindi se una proteina ha più aa idrofobici esposti sulla superficie precipiterà più facilmente in una soluzione salina a bassa concentrazione.
La stessa proteina si comporta in modo diverso a seconda del sale in soluzione.
Più il sale è grande e maggiori saranno le molecole d’acqua che lo vanno a solvatare quindi più facilmente le proteine si aggregano e precipitano.
Sali più piccoli hanno un effetto minore quindi si devono raggiungere forze ioniche elevate per far diminuire la solubilità.
Dipende da:
- dimensione ione
- idratazione ione
Precipitazione frazionata
Si immagina di avere un campione di partenza dove c’è l’ESTRATTO PROTEICO TOTALE (proteina bersaglio e proteine contaminanti).
Progressivamente si può AUMENTARE la CONCENTRAZIONE del SALE in maniera sono più IDROFOBICHE della PROTEINA DI INTERESSE (esperimento pilota: proteina precipita ad una determinata concentrazione di sale per cui si aumenta la concentrazione fino ad arrivare ad una % inferiore a quella che determina la precipitazione della proteina).
A questo punto si CENTRIFUGA il CAMPIONE e si preleva il SUPERNATANTE che contiene la PROTEINA DI INTERESSE.
Si AUMENTA la CONCENTRAZIONE SALINA in maniera tale da favorire la PRECIPITAZIONE della PROTEINA DI INTERESSA e tramite CENTRIFUGAZIONE si recupera il PELLET che è fortemente ARRICCHITO della FRAZIONE di PROTEINA DI INTERESSE anche se contiene proteine contaminanti.
SI ELIMINA il SUPERNATANTE.
Il sistema di PRECIPITAZIONE CON SALI permette di recuperare la SOLUBILITA’ delle PROTEINE quando la CONCENTRAZIONE SALINA viene ABBASSATA facendo DIALIZZARE il campione contro una SOLUZIONE SALINA a BASSA CONCENTRAZIONE in maniera tale da riportare le PROTEINE IN SOLUZIONE.
Di solito viene utilizzato il SOLFATO DI AMMONIO che è un SALE GRANDE con una capacità di PRECIPITARE le PROTEINE MAGGIORE ed è estremamente SOLUBILE quindi si riesce a raggiungere una FORZA IONICA ELEVATA di una soluzione in breve tempo
Esempio di precipitazione frazionata: arricchire una frazione del campione di interesse cercando di eliminare le proteine contaminanti
Man mano che si procede con la precipitazione frazionata si deve monitorare la proteina di interesse per esempio attraverso dei saggi enzimatici (se la proteina è dotata di attività enzimatica) per vedere se l’attività della proteina è nel supernatante o se è stata persa e la proteina è precipitata. Si può leggere l’assorbimento a 280 nm del supernatante: se diminuisce la proteina sta precipitando.
Si ha un estratto proteico totale e si aggiunge solfato di ammonio
- 10% solfato di ammonio nella soluzione: qualcosa inizia a precipitare. Si prende parte del supernatante e si fa una lettura a 280 nm confrontandola con quella fatta prima del processo e si nota che l’assorbimento è diminuito. Questo significa che le proteina stanno precipitando.
Ipotizzando che la proteina sia dotata di attività enzimatica si realizza un saggio enzimatico e si verifica che l’attività è tutta nel supernatante perché il suo livello è lo stesso della soluzione di partenza
- 20% solfato di ammonio nella soluzione: si legge l’assorbimento a 280 nm e si vede che è diminuito quindi sono precipitate altre proteine mentre l’attività enzimatica non ha subito variazioni
- 30% solfato di ammonio nella soluzione: l’assorbimento continua a diminuire quindi precipita una discreta quantità di proteina e l’attività enzimatica è alta ma inizia a diminuire quindi una piccola quantità di proteina inizia a precipitare ma la maggior parte è ancora nel supernatante.
A questo punto si elimina il precipitato facendo una centrifugazione e recuperando il supernatante contenente la proteina di interesse
- 40% - 50% solfato di ammonio nella soluzione: l’assorbimento diminuisce ancora ma di poco che significa che le proteine contaminanti sono state eliminate negli step precedenti, ma diminuisce notevolmente l’attività enzimatica quindi la proteina sta precipitando
- 60% solfato di ammonio nella soluzione: l’attività enzimatica è molto bassa quindi quasi tutta la proteina è precipitata.
A questo punto si può recuperare il pellet attraverso una centrifugazione eliminando il supernatante.
In questo processo la resa è diminuita di molto ma l’attività specifica è aumentata notevolmente
Frazionamento con solventi organici
I SOLVENTI ORGANICI sono MISCIBILI con l’ACQUA (es. etanolo, acetone, butanolo, etanolo).
Le PROTEINE tendono a PRECIPITARE quando vengono AGGIUNTI questi SOLVENTI ORGANICI all’ACQUA dal momento che questi ABBASSANO la COSTANTE DIELETTRICA dell’ACQUA e la rendono MENO EFFICACE nel DISSOLVERE gli IONI.
La costante dielettrica dell’acqua è 80 e significa che l’acqua ha un potere di diminuire la forza di attrazione tra due cariche di ben 80 volte rispetto alla forza di attrazione che queste avrebbero avuto nel vuoto.
Nel momento in cui si ABBASSA la COSTANTE DIELETTRICA dell’ACQUA aggiungendo i SOLVENTI ORGANICI si favorisce la PRECIPITAZIONE delle PROTEINE perché essendo le proteine sciolte in un mezzo APOLARE, è il MEZZO APOLARE che va a SOLVATARE le REGIONI IDROFOBICHE delle proteine e le MOLECOLE D’ACQUA si dispongono ad IDRATARE le MOLECOLE di SOLVENTE ORGANICO scoprendo le REGIONI CARICHE delle proteine che ATTRAENDOSI si AGGREGANO.
Questa AGGREGAZIONE tra le proteine determina la loro PRECIPITAZIONE e le MOLECOLE tendono ad USCIRE dalla SOLUZIONE.
I SOLVENTI ORGANICI tendono a portare alla DENATURAZIONE delle proteine quindi è più DIFFICILE recuperare la loro SOLUBILITA’ nel momento in cui si allontana il solvente organico.
Per evitare la denaturazione eccessiva si lavora a temperature vicine allo 0 o inferiori
Frazionamento con polietilenglicole (PEG)
E’ un OSSIDO DI POLIETILENE (polimero organico).
Il vantaggio di utilizzare il PEG è che sono richieste delle CONCENTRAZIONI PIU’ BASSE per consentire la PRECIPITAZIONE delle PROTEINE e ha un MINORE EFFETTO DENATURANTE.
E’ un processo simile a quello del frazionamento con solventi organici
Frazionamento in base al punto isoelettrico
Quando si trovano ad un pH CORRISPONDENTE al proprio PUNTO ISOELETTRICO, le PROTEINE tendono ad AGGREGARSI e a PRECIPITARE.
Alcuni aa hanno catene laterali ionizzabili e il punto isoelettrico delle proteine è legato al tipo e al numero di aa basici e acidi all’interno della proteina stessa.
- pH > PUNTO ISOELETTRICO: proteina carica NEGATIVAMENTE
- pH < PUNTO ISOELETTRICO: proteina carica POSITIVAMENTE
- pH = PUNTO ISOELETTRICO: proteina NEUTRA
A valori di pH SUPERIORI e INFERIORI al PUNTO ISOELETTRICO le PROTEINE tendono a RESPINGERSI perché sono dotate della STESSA CARICA di SUPERFICIE.
Invece quando il pH CORRISPONDE al PUNTO ISOELETTRICO le PROTEINE tendono ad AGGREGARSI per ATTRAZIONE TRA CARICHE e quindi le PROTEINE sono MENO SOLUBILI
Grafico: influenza concentrazione salina sulla solubilità della lattoglobulina
A concentrazioni molto basse ha solubilità diverse.
Solubilità maggiore quando proteina si trova in soluzione a forza ionica moderata.
Solubilità bassa quando proteina si trova in soluzioni a forza ionica bassa (1 mM o 5 mM).
Se la forza ionica aumenta (10 mM o 20 mM) la solubilità aumenta ma a quella specifica concentrazione salina il valore di solubilità è minimo quando pH = punto isoelettrico
Frazionamento per denaturazione
La DENATURAZIONE di una proteina può avvenire per RISCALDAMENTO (T>40°C).
Una PROTEINA che si DENATURA è INSOLUBILE dal momento che PERDE la sua CONFIGURAZIONE TRIDIMENSIONALE e quindi PRECIPITA.
Si può realizzare un esperimento su piccola scala per capire quale è la TEMPERATURA CRITICA (T di denaturazione) e il TEMPO e poi SCALDARE la MISCELA ad una T inferiore a quella critica della PROTEINA DI INTERESSE in maniera tale da far PRECIPITARE e ALLONTANARE le PROTEINE CONTAMINANTI, mantenere in FORMA SOLUBILE la PROTEINA DI INTERESSE e lavorare con il SUPERNATANTE
