Elettroforesi Flashcards

Question

Elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE)

Answer 1

Consente di SEPARARE PROTEINE esclusivamente in base alla DIMENSIONE quindi all'effetto setaccio molecolare effettuato dalle maglie del gel. Bisogna considerare che la separazione delle molecole cariche è in base al rapporto carica/massa

Answer 2

Le PROTEINE NON vengono DENATURATE, non si alterano le caratteristiche strutturali e di carica delle proteine. Vengono mantenute nella loro CONFORMAZIONE TRIDIMENSIONALE e mantengono il loro PUNTO ISOELETTRICO. Questo consente di SEPARARE le PROTEINE anche nella loro FORMA FUNZIONALE. Questo tipo di elettroforesi viene utilizzato quando si vuole IDENTIFICARE una PROTEINA in base alla sua ATTIVITA' BIOLOGICA all'interno del gel

Answer 3

Consente di SEPARARE le PROTEINE in funzione del loro PUNTO ISOELETTRICO e di determinare il PUNTO ISOELETTRICO delle PROTEINE

Answer 4

Viene utilizzata per l'ANALISI di MISCELE MOLTO COMPLESSE di PROTEINE

Answer 5

- Le PROTEINE NON vengono DENATURATE, non subiscono pretrattamento prima dell'elettroforesi ma si SCEGLIE il pH a cui condurre l'elettroforesi. Dal pH dipende lo STATO DI IONIZZAZIONE delle proteine - Le PROTEINE conservano la loro STRUTTURA TRIDIMENSIONALE e la loro CARICA NATIVA quindi possono essere anche RICONOSCIUTE tramite la loro ATTIVITA' BIOLOGICA all'interno del gel - NON DENATURANDO le PROTEINE e NON utilizzando AGENTI RIDUCENTI nel sistema, i PONTI DISOLFURO rimangono INTATTI e la SEPARAZIONE avviene in base al RAPPORTO CARICA/MASSA -Questo sistema ha la possibilità di SEPARARE delle PROTEINE che abbiano una EGUALE MASSA ma CARICA DIFFERENTE

Answer 6

- Le PROTEINE devono essere PRETRATTATE con un AGENTE DENATURANTE. Di norma si utilizza l'SDS cioè il SODIO DODECIL SOLFATO - Le MOLECOLE di SDS essendo dotate di CARICA NEGATIVA (testa carica negativamente di solfato) si LEGANO alle PROTEINE MASCHERANDONE la CARICA NEGATIVA - Tutte le PROTEINE in queste condizioni risultano essere CARICHE NEGATIVAMENTE - Oltre all'SDS viene AGGIUNTO alla MISCELA DI REAZIONE un AGENTE RIDUCENTE che ha la funzione di ROMPERE i PONTI DISOLFURO e garantire la COMPLETA DENATURAZIONE delle proteine - Tutte le PROTEINE hanno lo STESSO RAPPORTO CARICA/MASSA. Di conseguenza la SEPARAZIONE avviene solo in base al PESO MOLECOLARE

Answer 7

L'SDS è il SODIO DODECIL SOLFATO. E' caratterizzato da una lunga CATENA di GRUPPI METILICI (12) e un GRUPPO SOLFATO che rappresenta la TESTA CARICA della molecola. L'SDS si COMPLESSA alle PROTEINE secondo uno specifico RAPPORTO STECHIOMETRICO di 1.4 g di SDS/1 g di PROTEINA (una molecola di SDS ogni 2 aa). Il fatto che il rapporto stechiometrico sia così preciso è importante perché consente di SEPARARE PROTEINE esclusivamente in base alla loro MASSA dal momento che il RAPPORTO CARICA/MASSA di tutte le proteine rimane INVARIATO. Il SODIO DODECIL SOLFATO in qualità di DETERGENTE è un AGENTE DESTRUTTURANTE per le PROTEINE dal momento che con la LUNGA CODA IDROFOBICA l'SDS tende ad ENTRARE all'interno del CORE IDROFOBICO delle proteine e a provocare una PERDITA della CONFIGURAZIONE TRIDIMENSIONALE. Se una proteina è caratterizzata da PONTI DISOLFURO, l'SDS da solo non riesce a destrutturare completamente la proteina, ma se viene AGGIUNTO un AGENTE RIDUCENTE come il DITIOTRITOLO o il BETA MERCAPTOETANOLO la PROTEINA PERDE completamente la sua CONFORMAZIONE. L'SDS si va a disporre intorno alla proteina e MASCHERA le CARICHE NEGATIVE o POSITIVE che erano caratteristiche della conformazione nativa della proteina. Le molecole di SDS sono talmente NUMEROSE che conferiscono alla PROTEINA una CARICA NETTA NEGATIVA. Oltre all'SDS e al DDT si aggiunge anche un TRATTAMENTO AL CALORE dal momento che il CAMPIONE PROTEICO prima di essere caricato sul gel viene BOLLITO. Le PROTEINE PERDONO completamente la loro CONFORMAZIONE in modo tale che l'SDS possa LEGARSI secondo il PRECISO RAPPORTO STECHIOMETRICO

Answer 8

Per l'elettroforesi su gel di poliacrilamide si utilizza un metodo detto DISCONTINUO perché vengono preparati DUE GEL UNO SOPRA L'ALTRO che hanno delle caratteristiche differenti. C'è un RUNNING GEL o RESOLVING GEL (LOWER GEL) che è quello in cui si può decidere di VARIARE la %T quindi decidere la DIMENSIONE delle MAGLIE del gel. Di solito per la separazione di proteine di media grandezza si sceglie una %T del 10-20% di acrilamide. L'altro gel prende il nome di STACKING GEL o GEL DI IMPACCAMENTO (UPPER GEL) e viene POLIMERIZZATO SOPRA il RUNNING GEL. L'upper gel viene definito gel di impaccamento o DI CARICAMENTO perché all'interno di questo gel si creano dei POZZETTI dove si CARICA il CAMPIONE pozzetto per pozzetto. La % di ACRILAMIDE dello STACKING GEL è BASSISSIMA rispetto a quella del running gel ed è FISSA 3.75%. Il metodo viene definito DISCONTINUO anche perché i TAMPONI che vengono utilizzati per la PREPARAZIONE DEI GEL sono DIVERSI: - RUNNING GEL: TRIS 3M a pH 8 - STACKING GEL: TRIS 0.5M a pH 6.8 (diverse concentrazioni e pH) - TAMPONE DI CORSA per riempire la CAMERA ELETTROFORETICA: TRIS GLICINA a pH 8.9

Answer 9

Il primo gel da preparare è il RUNNING GEL dal momento che nell'apparato bisogna colare il GEL LIQUIDO fra DUE LASTRINE che sono APPAIATE tra di loro. Si ipotizza una PREPARAZIONE AL 15% di T e partendo da una SOLUZIONE di ACRILAMIDE con 30% di T (29:1) si mettono 2.5 ml di questa SOLUZIONE in un VOLUME FINALE di 5 ml. Si va a DILUIRE 1:2 la SOLUZIONE di ACRILAMIDE. Gli altri COMPONENTI della soluzione sono un TAMPONE definito LOWER GEL BUFFER, lo STOCK che si prepara è un TRIS-HCl 3M a pH 8.8. Il TRIS è una BASE che viene portata ad un pH di circa 10-11 quando viene SCIOLTA in ACQUA per cui viene portata a pH DI ESERCIZIO da HCl. Si fa quindi una TITOLAZIONE. Si mette ACQUA poi vengono aggiunti SDS, APS e TEMED. Si PIPETTANO queste QUANTITA' e si VERSA il GEL fra le DUE LASTRINE. Calcolare la CONCENTRAZIONE FINALE: se si ha un V FINALE di 5 ml e su 5 ml sono stati messi 0.625 ml di LOWER GEL BUFFER si può calcolare il FATTORE DI DILUIZIONE facendo 5/0.625. A questo punto la CONCENTRAZIONE dello STOCK che è 3M si divide per il FATTORE DI DILUIZIONE. Questo dà la CONCENTRAZIONE FINALE del TRIS-HCl nella SOLUZIONE di 5 ml. Si può anche utilizzare v1:c1=v2:c2. Si prepara il LOWER GEL, si DEGRADA dal momento che l'ossigeno può interagire con i radicali liberi e può interferire con la polimerizzazione radicalica. Poi la SOLUZIONE viene VERSATA fra le DUE LASTRINE. Si aspetta il TEMPO necessario affinché POLIMERIZZI (15-20 minuti) e nel frattempo si prepara la SOLUZIONE per lo STACKING GEL

Answer 10

Lo stacking gel ha una % di ACRILAMIDE FISSA a 3.75%. Vuol dire che le MAGLIE sono molto GRANDI dal momento che non deve fare da setaccio molecolare visto che le proteine si separano nel running gel. Si deve creare un ambiente in cui caricare le proteine. Le PROTEINE indipendentemente dalla dimensione devono MIGRARE INSIEME e arrivare sul TOP del RUNNING GEL. A questo punto le PROTEINE si FERMANO perché trovano delle MAGLIE PIU' STRETTE del gel e si SEPARANO in base al PESO MOLECOLARE. In questo caso la SOLUZIONE DI GEL contiene ACRILAMIDE in una SPECIFICA QUANTITA' tale per cui si può avere una %T di 3.75%, un UPPER GEL BUFFER che è un TRIS-HCl 0.5M a pH 6.8, ACQUA, SDS, APS e TEMED. Il V FINALE di questo GEL è 2.5 ml. Si calcolano le CONCENTRAZIONI FINALI

Answer 11

Una volta POLIMERIZZATO il RUNNING GEL si va a COLARE SOPRA questo lo STACKING GEL, poi si inserisce un PETTINE all'interno dello STACKING GEL in maniera tale che si possano formare i POZZETTI DENTELLATI dove si andrà a CARICARE il CAMPIONE

Answer 12

Prima della carica del campione il GEL si TRASFERISCE all'interno di un SUPPORTO che contiene gli ELETTRODI che sono fondamentali per poter applicare la corrente e consentire la migrazione delle proteine cariche sotto l'azione di un campo elettrico. In questo SUPPORTO ci sono delle ALETTE da una parte e dall'altra dove vanno INCASTRATE le LASTRINE. Qualora dovesse CORRERE un SOLO GEL si mettono le LASTRINE da una PARTE e dall'ALTRA PARTE un SUPPORTO DI PLASTICA che ha esattamente le STESSE DIMENSIONI di una LASTRINA. Se invece devono CORRERE DUE GEL si metteranno UNO da una PARTE e UNO dall'ALTRA. E' importante inserire i DUE GEL o un GEL e una LASTRINA ai DUE LATI del SUPPORTO dal momento che si deve CHIUDERE da entrambe le parti in modo tale da formare una CAMERETTA INTERNA che sia perfettamente A TENUTA. La TENUTA è GARANTITA da un GOMMINO VERDE che va a PREMERE contro le LASTRINE. Nel POSIZIONARE il GEL all'interno del SUPPORTO la LASTRINA PIU' PICCOLA va rivolta verso l'INTERNO della CAMERA. In questa posizione si CARICANO i CAMPIONI nei POZZETTI presenti nell'upper gel. Successivamente si posizionano i GEL all'interno della CAMERA che consente di tenere il SUPPORTO in POSIZIONE VERTICALE. Ci sono DUE PORTICINE che vengono CHIUSE in maniera tale da PREMERE le LASTRINE contro il GOMMINO VERDE e creare una CAMERA INTERNA A TENUTA

Answer 13

La CAMERETTA INTERNA viene completamente RIEMPITA dal TAMPONE DI CORSA (tris glicina a pH 8.9) che FUORIESCE all'ESTERNO dal momento che il gel è posizionato nella camera elettroforetica dove si fa la corsa. La CAMERA ELETTROFORETICA non deve essere necessariamente riempita completamente dal TAMPONE DI CORSA ma questo deve COPRIRE il FONDO DEL GEL (immerso nel tampone di corsa). Questo consente al GEL di essere in CONTATTO DIRETTO con il TAMPONE DI CORSA DAL TOP fino al FONDO. Questo è fondamentale perché la maggior parte della CORRENTE viene TRASPORTATA dagli IONI del TAMPONE e solo una piccola parte degli ioni del campione. Nel frattempo che l'UPPER GEL POLIMERIZZA si deve preparare il TAMPONE DI CORSA cioè quello con cui si andrà a riempire la camera elettroforetica. Il TAMPONE DI CORSA è formato da TRIS, GLICINA e SDS. Il TRIS e la GLICINA sono in POLVERE quindi devono essere PESATI e SCIOLTI in ACQUA. Si pesano 3g di TRIS per LITRO e 14.4g di GLICINA per LITRO. Si parte da uno STOCK di SDS del 10% e se ne mettono 10 ml in un LITRO. Si calcolano le CONCENTRAZIONI FINALI

Answer 14

Si può iniziare a PREPARARE il CAMPIONE che si deve CARICARE sul GEL. Il CAMPIONE deve essere SOLUBILIZZATO in un SAMPLE BUFFER cioè il TAMPONE DEL CAMPIONE. Il SAMPLE BUFFER si prepara in CONCENTRAZIONE 2x, significa che ha una CONCENTRAZIONE di ciascun COMPONENTE PARI AL DOPPIO di quella che sarà la CONCENTRAZIONE DI ESERCIZIO (è 2 volte più concentrato). Si prepara 2x perché deve essere AGGIUNTO ad un CAMPIONE che ha un certo VOLUME. I COMPONENTI del sample buffer sono TRIS 0.5M a pH 6.8 (stesso buffer dello stacking gel). E' importante perché si SOLUBILIZZA il CAMPIONE in un TAMPONE allo STESSO pH in cui si troverà quando viene CARICATO. Il sample buffer contiene SDS, DTT che riduce i PONTI DISOLFURO del campione proteico, poi ci sono altri due elementi che sono il GLICEROLO che AUMENTA la DENSITA' del CAMPIONE in maniera tale che quando si va a CARICARE il CAMPIONE nei POZZETTI SEDIMENTA subito sul FONDO del pozzetto e NON DIFFONDE nella soluzione. L'altro elemento è il BLU DI BROMOFENOLO che è un COLORANTE che serve da TRACCIANTE della corsa elettroforetica. Il blu di bromofenolo è una MOLECOLA PICCOLA e si muove PIU' VELOCEMENTE delle più PICCOLE PROTEINE durante il processo elettroforetico e la sua funzione è quella di DARE UN'IDEA di QUANDO si deve INTERROMPERE il processo elettroforetico. Se le PROTEINE NON sono dotate di GRUPPI CROMOFORI NON si possono VEDERE all'interno del GEL quindi NON si può VEDERE la loro MIGRAZIONE per questo si segue la MIGRAZIONE del BLU DI BROMOFENOLO che avanza in maniera tale che si può INTERROMPERE il processo elettroforetico quando il BLU DI BROMOFENOLO è arrivato sul FONDO del GEL perché questo garantisce che TUTTE le PROTEINE sono all'INTERNO. Se non ci fosse questo tracciante non si saprebbe quanto debba durare la corsa elettroforetica oppure se si interrompesse troppo tardi le proteine più piccole potrebbero già essere andate perse che una volta arrivate sul fondo del gel escono e vanno nella soluzione. Una volta SOLUBILIZZATI i CAMPIONI all'interno del SAMPLE BUFFER, questi vengono sottoposti a BOLLITURA a 100°C per 2-3 MINUTI. Questo processo di bollitura porta ad una TOTALE DENATURAZIONE del CAMPIONE

Answer 15

A questo punto si può CARICARE il CAMPIONE sul GEL e realizzare la CORSA ELETTROFORETICA o a CORRENTE COSTANTE o a VOLTAGGIO COSTANTE. Quindi si può realizzare una SEPARAZIONE A CORRENTE COSTANTE di 10-20 mA per GEL oppure A VOLTAGGIO COSTANTE a 200 V (indipendentemente dal numero di gel). Questo sistema di separazione viene maggiormente utilizzato perché è molto rapido (circa 1 ora), tuttavia le bande possono risultare meno focalizzate rispetto a quelle che si possono avere con una corsa a corrente costante. Nel momento in cui si ha il PASSAGGIO ELETTROFORETICO, si applica la DIFFERENZA DI POTENZIALE tra gli elettrodi e inizia il TRASPORTO DI CORRENTE, i CAMPIONI iniziano ad ASSOTTIGLIARSI e nello STACKING GEL MIGRANO sotto forma di una BANDA MOLTO SOTTILE

Answer 16

Sono la % di ACRILAMIDE e la DIFFERENZA di pH tra i TAMPONI che vengono utilizzati per l'UPPER e per il LOWER GEL

Answer 17

Le MAGLIE dell'UPPER GEL devono essere PIU' LARGHE dal momento che questo è solo un GEL DI CARICAMENTO, le PROTEINE NON devono subire nessun RALLENTAMENTO nella MIGRAZIONE attraverso l'UPPER GEL dal momento che la vera SEPARAZIONE delle PROTEINE in base al loro PESO MOLECOLARE avviene a partire DAL TOP del LOWER GEL

Answer 18

Il GEL è IMMERSO nel TAMPONE DI CORSA che è presente all'interno della cameretta interna a tenuta quindi il top del gel è a diretto contatto con il tampone di corsa che è anche nel contenitore esterno quindi anche il fondo del gel è immerso nel tampone di corsa. Il tampone di corsa è un tris glicina a pH 8.9. Il tris viene portato a pH tramite HCl. Ci sono degli IONI Cl- dal momento che nel TAMPONE DI CORSA e nel TAMPONE DI PREPARAZIONE del LOWER GEL BUFFER e SAMPLE GEL BUFFER c'è del TRIS HCl. L'HCl è un ACIDO FORTE che si DISSOCIA in IONI H+ e IONI Cl- quindi c'è una grande quantità di ioni Cl-. Il tampone di corsa è un TRIS GLICINA. La GLICINA è un AA IONIZZABILE quindi a seconda del pH in cui si trova può assumere una CARICA POSITIVA o una CARICA NEGATIVA. Altri IONI sono quelli del CAMPIONE dal momento che le PROTEINE in presenza di SDS sono tutte CARICHE NEGATIVAMENTE. Nel momento in cui si avvia il PROCESSO ELETTROFORETICO gli IONI cominciano a MUOVERSI e gli IONI NEGATIVI MIGRANO verso il POLO POSITIVO quindi si muovono DAL TOP del gel verso il FONDO del gel. Gli IONI Cl- sono estremamente PICCOLI quindi molto VELOCI e MOBILI all'interno del gel per cui saranno quelli che si MUOVONO PIU' VELOCEMENTE nello STACKING GEL e nel LOWER GEL. La GLICINA ENTRA nel GEL dal momento che il TAMPONE DI CORSA si trova a STRETTO CONTATTO con il GEL e quando la GLICINA si trova a pH 6.8 che è quello dello STACKING GEL, si trova in FORMA ZWITTERIONICA perché è a pH FISIOLOGICO. La GLICINA come ZWITTERIONE NON è dotata di una grande MOBILITA' ELETTROFORETICA, si MUOVE perché TRAINATA da altri IONI. Anche i COMPLESSI PROTEINA-SDS CARICHI NEGATIVAMENTE si muovono verso il POLO POSITIVO. Quindi si muovono prima gli ioni Cl-, poi i complessi proteina-SDS e infine la glicina in forma zwitterionica. Nel momento in cui si raggiunge il RUNNING GEL, la GLICINA a pH 8.9 si CARICA NEGATIVAMENTE e tende a SUPERARE i COMPLESSI PROTEINA-SDS e a migrare dietro gli ioni Cl-. I COMPLESSI PROTEINA-SDS sono RALLENTATI dalle MAGLIE del LOWER GEL che fungono da SETACCIO MOLECOLARE. Per cui queste DUE UNITA' di pH di DIFFERENZA tra il OWER GEL e l'UPPER GEL comportano che nell'UPPER GEL le PROTEINE MIGRANO sotto forma di una BANDA SOTTILE schiacciata tra due fronti di IONI. Nel momento in cui si arriva nel LOWER GEL, la GLICINA si IONIZZA sotto forma di IONI GLICINATO e tende a SUPERARE i COMPLESSI PROTEICI PROTEINA-SDS perché questi sono più GRANDI dello ione glicinato. Quindi i COMPLESSI PROTEINA-SDS MIGRANO più LENTAMENTE e si SEPARANO in funzione del loro PESO MOLECOLARE

Answer 19

L'SDS PAGE consente anche di INDIVIDUARE il PESO MOLECOLARE delle proteine qualora non si conoscesse. In un gel di poliacrilamide insieme ai COMPLESSI PROTEICI anche dei MARCATORI di PESO MOLECOLARE cioè delle PROTEINE con un PM NOTO. In relazione alla DIMENSIONE delle proteine che si devono SEPARARE nel GEL si scelgono gli opportuni MARCATORI DI PESO MOLECOLARE che vengono definiti - STANDARD LOW RANGE: proteine di BASSO PM (14.4-87.4 kDa) - STANDARD HIGH RANGE: 45-200 kDa - BROAD RANGE: range più vasti (6.5-200 kDa) Ce ne sono alcuni che sono PRECOLORATI, ci sono delle BANDE CONIUGATE a dei CROMOFORI e questo consente di vedere la SEPARAZIONE delle proteine durante il corso dell'ELETTROFORESI. Questo tipo di marcatori precolorati sono importanti quando si deve realizzare un western blotting cioè un trasferimento di proteine su nitrocellulosa. Questi marcatori vengono trasferiti sulla nitrocellulosa e risultano visibili perché le bande sono tutte colorate. In gel si CARICANO i MARCATORI DI PESO MOLECOLARE e nel POZZETTO ADIACENTE il CAMPIONE DI INTERESSE. A questo punto si può costruire una RETTA DI TARATURA in cui sulle ORDINATE si mette il LOGARITMO DEL PM e sulle ASCISSE la MIGRAZIONE DELLE PROTEINE all'interno del gel

Answer 20

Si intende il CALCOLO del FATTORE DI RITARDO (Rf). Rf si calcola facendo il RAPPORTO di x/y dove x è la DISTANZA DI MIGRAZIONE della PROTEINA DAL TOP del GEL AL PUNTO in cui questa proteina è ARRIVATA al TERMINE della corsa elettroforetica e y è l'ALTEZZA del GEL. Il FATTORE DI RITARDO può essere calcolato per ognuna delle PROTEINE A PM NOTO in maniera tale da poter costruire un GRAFICO in cui si pone il FATTORE DI RITARDO in relazione al LOGARITMO DEL PM di queste proteine. Questo GRAFICO consente di TRACCIARE una RETTA DI TARATURA. Si ESTRAPOLA la MIGLIOR RETTA PASSANTE PER I PUNTI. La caratteristica di questa RETTA STANDARD è la TENDENZA è INVERSA infatti l'EQUAZIONE di questa RETTA è D(Rf)= a - b logPM. Il COEFFICIENTE ANGOLARE di questa RETTA è NEGATIVO (-b) quindi la TENDENZA è INVERSA. MINORE è la DISTANZA PERCORSA dalla PROTEINA all'interno del GEL, MAGGIORE è il suo PM. Una volta costruita la retta si può calcolare l'Rf della proteina di interesse, si riporta sul grafico, si traccia la DIRETTRICE sulla RETTA DI TARATURA PERPENDICOLARE all'ASSE delle ORDINATE e si trova il LOGARITMO DEL PM corrispondente alla PROTEINA

Answer 21

Al termine di una separazione elettroforetica si devono VISUALIZZARE le PROTEINE sul GEL. A meno che non si utilizzino degli standard di peso molecolare precolorati, le proteine se non sono dotate di cromofori che assorbono nel visibile non si vedono. Per questo si utilizza il blu di bromofenolo come tracciante della corsa elettroforetica. Una volta interrotto il processo elettroforetico bisogna COLORARE il GEL in modo da rendere VISIBILI le PROTEINE. Come COLORANTI ci sono il COOMASSIE BRILLIANT BLUE R250 e G250. Nel G250 sono presenti DUE GRUPPI METILICI in PIU' rispetto all'R250. Il COOMASSIE G250 ha una SOLUBILITA' DIVERSA in condizioni ACIDE rispetto all'R250 e può avere degli utilizza diversi. Il COOMASSIE interagisce con i GRUPPI CARICHI POSITIVAMENTE degli AA delle PROTEINE dal momento che ci sono dei GRUPPI SOLFATO CARICHI NEGATIVAMENTE nella molecola. Inoltre, realizza delle INTERAZIONI DEBOLI IDROFOBICHE con AA AROMATICI. Questo COOMASSIE consente di RILEVARE QUANTITA' DI PROTEINA nell'ordine di 50-100 ng. Quanto MAGGIORE è la QUANTITA' di proteina tanto più INTENSA è la BANDA VISUALIZZATA, ma si riescono anche a vedere delle BANDE definite FAINT (DEBOLI) dove ci sono POCHI ng di PROTEINA. Ci sono ALTRI COLORANTI che si basano sull'UTILIZZO del COOMASSIE G250 e risultano essere più SENSIBILI rispetto al commassie R250. Si riesce a VISUALIZZARE sul GEL anche una QUANTITA' DI PROTEINA pari a 8 ng. Inoltre le BANDE risultano a CONTRASTO rispetto al FONDO del GEL. Il COOMASSIE G250 NON INTERAGISCE quasi per niente con la MATRICE di GEL mentre quando si termina una COLORAZIONE di un GEL con COOMASSIE R250 il GEL è quasi tutto BLU. Si riescono a DISTINGUERE le BANDE MOLTO INTENSE ma quelle DEBOLI NON si VEDONO. Quindi si fanno delle FASI DI DECOLORAZIONE del GEL con delle SOLUZIONI contenenti ACIDO ACETICO e METANOLO che tendono ad ELIMINARE il COOMASSIE che si è specificamente LEGATO alla MATRICE mentre quello LEGATO alle PROTEINE NON viene ELIMINATO. Man mano che si SCHIARISCE il FONDO del GEL si rendono più EVIDENTI le BANDE DEBOLI. Il COOMASSIE G250 NON INTERAGISCE con la MATRICE e quindi al TERMINE della COLORAZIONE che molto è più veloce dell'altra si vedono le BANDE BEN VISIBILI perché il FONDO del GEL è CHIARO. Il COOMASSIE G250 ha la caratteristica di formare una SOLUZIONE COLLOIDALE. Il coomassie viene preparato in una SOLUZIONE di ACIDO ORTOFOSFORICO e AMMONIO SOLFATO. All'interno di questa soluzione il COOMASSIE risulta POCO SOLUBILE per cui c'è una SOSPENSIONE. Quando si AGGIUNGE questa SOLUZIONE COLLOIDALE al GEL, il COOMASSIE si LEGA alle PROTEINE quindi va in soluzione solo la QUANTITA' di COOMASSIE che è in grado di LEGARSI alle proteine. Quando NON ci sono più PROTEINE che devono LEGARE il COOMASSIE questo NON va più in SOLUZIONE. C'è un EQUILIBRIO tra il COOMASSIE COLLOIDALE e il COOMASSIE che va in SOLUZIONE per cui il COOMASSIE possa DALLA SOLUZIONE ALLA SOLUZIONE VERA E PROPRIA solo se ci sono delle PROTEINE che possono LEGARSI ad esso. Qualora TUTTE le PROTEINE siano SATURE il COOMASSIE ritorna allo STATO COLLOIDALE. Questo consente di fare in modo che il COOMASSIE NON vada ad INTERAGIRE con la MATRICE

Answer 22

E' una COLORAZIONE ESTREMAMENTE SENSIBILE. Si riesce a VISUALIZZARE anche 1 ng di PROTEINA. Si basa sull'utilizzo di una SOLUZIONE di IONI ARGENTO che vanno ad INTERAGIRE con le CATENE degli AA ACIDI quindi con i GRUPPI CARBOSSILICI e in parte con i GRUPPI SULFIDRILICI delle PROTEINE. Successivamente viene AGGIUNTA una SOLUZIONE che favorisce la RIDUZIONE di questo IONE ARGENTO ad ARGENTO METALLICO. L'ARGENTO METALLICO PRECIPITA nel PUNTO in cui si è LEGATO alla PROTEINA formando delle BANDE di COLORE MOLTO SCURO (marrone)

Answer 23

Si utilizzano dei COLORANTI FLUORESCENTI che si LEGANO alle PROTEINE e per VISUALIZZARE sul GEL bisogna ECCITARE i COLORANTI a una SPECIFICA LUNGHEZZA D'ONDA. Quando le MOLECOLE ritornano allo STATO FONDAMENTALE EMETTONO una RADIAZIONE LUMINOSA che consente di VISUALIZZARE le PROTEINE sul GEL. E' un sistema che si usa per la colorazione di miscele di proteine molto complesse in particolare quelle che derivano da elettroforesi bidimensionale

Answer 24

Il GEL DI POLIACRILAMIDE può essere utilizzato per realizzare una QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE direttamente sul gel. Si possono CARICARE delle PROTEINE che abbiano delle CONCENTRAZIONI NOTE quindi si sa esattamente una DETERMINATA BANDA che corrisponde ad una PROTEINA con un certo PM ma a quella proteina corrisponde anche una SPECIFICA QUANTITA' in µg. A questo punto si può CONFRONTARE l'INTENSITA' della BANDA PROTEICA di cui si CONOSCE la QUANTITA' con ALTRE BANDE PROTEICHE di cui si vuole DETERMINARE la QUANTITA'. Si effettua la DENSITOMETRIA A SCANSIONE. Si fa la SCANSIONE del GEL con un DENSITOMETRO: si fa ATTRAVERSARE il GEL da un RAGGIO DI LUCE e si misura la LUCE TRASMESSA. Dove NON ci sono le BANDE PROTEICHE la LUCE sarà MASSIMA, mentre dove ci sono le BANDE PROTEICHE la LUCE viene ASSORBITA. Quindi il VALORE DI ASSORBIMENTO di LUCE TRASMESSA può essere TRASFORMATO in una sorta di PICCO (luce assorbita) che sarà tanto MAGGIORE quanto più è GRANDE l'INTENSITA' della BANDA sul GEL. Mettendo a CONFRONTO l'AREA di PICCHI derivanti da PROTEINE a QUANTITA' NOTA si può determinare la QUANTITA' delle PROTEINE presenti all'interno del GEL. Ci sono diversi APPARATI ELETTROFORETICI: alcuni sono per PREPARARE PICCOLI GEL (biorad 8x10 cm), altri invece per GEL PIU' GRANDI (biorad 16x16 cm), La scelta viene realizzata in base al tipo di separazione e alla complessità delle proteine che si devono separare. Nel caso di un'elettroforesi bidimensionale che viene utilizzata per l'analisi di proteomi quindi di tutto il pool di proteine presenti in un campione biologico si preferisce usare dei gel più grandi che consentono la separazione di campioni più complessi

Answer 25

Per la SEPARAZIONE DI ACIDI NUCLEICI si utilizza il GEL DI AGAROSIO. Il GEL DI AGAROSIO consente di formare delle MAGLIE PIU' GRANDI perché le molecole di DNA sono PIU' GRANDI delle PROTEINE. La % del GEL può essere VARIATA in modo tale da formare delle MAGLIE più o meno GRANDI in funzione delle MOLECOLE che si devono SEPARARE. L'AGAROSIO è un POLISACCARIDE costituito da UNITA' ALTERNATE di GALATTOSIO e di 3,6 ANIDROGALATTOSIO. Queste UNITA' DISACCARIDICHE prendono il nome di AGAROBIOSIO. L'agarosio viene venduto sotto forma di polvere. Nel momento in cui si deve PREPARARE il GEL, viene SOLUBILIZZATO all'interno di un TAMPONE, ma deve essere SCALDATO e PORTATO quasi alla TEMPERATURA DI EBOLLIZIONE del TAMPONE (intorno ai 100°C) per poter consentire la SOLUBILIZZAZIONE dell'AGAROSIO (agarobiosio). Nel momento in cui la SOLUZIONE è completamente LIQUIDA, MOLTO CALDA e si lascia RAFFREDDARE a TEMPERATURA AMBIENTE, le CATENE DI POLISACCARIDI vanno ad INTERAGIRE fra loro formando delle INTERAZIONI DEBOLI (legami H) e vanno a formare un RETICOLO A MAGLIE. Quanto MAGGIORE sarà la % di AGAROSIO all'interno del GEL PIU' STRETTE saranno le MAGLIE che si verranno a formare. C'è un EFFETTO SETACCIO esercitato dal GEL nei confronti delle molecole che si devono SEPARARE. La SEPARAZIONE avviene in base alla MASSA perché le molecole di DNA e RNA sono CARICHE NEGATIVAMENTE per la presenza del GRUPPO FOSFATO nello scheletro della catena e di conseguenza quanto MAGGIORE sarà la DIMENSIONE della molecola di DNA, quindi MAGGIORE il NUMERO DI NUCLEOTIDI, MAGGIORE sarà la CARICA in relazione alla MASSA. Di conseguenza il RAPPORTO CARICA/MASSA sarà UGUALE per tutte le MOLECOLE. In un'elettroforesi su gel di agarosio il DNA che è CARICO NEGATIVAMENTE si sposterà verso il POLO POSITIVO e la MIGRAZIONE dipenderà dalle DIMENSIONI della molecola e dall'EFFETTO SETACCIO esercitato dal gel di agarosio

Answer 26

L'agarosio viene venduto sotto forma di POLVERE quindi viene PESATO. Se si vuole fare un GEL allo 0.8-1% di AGAROSIO, si PESANO 0.8-1 g di AGAROSIO e si SCIOLGONO in 100 ml di TAMPONE. Quindi si pesa la QUANTITA' di AGAROSIO opportuna, si trasferisce in una BEUTA, si aggiunge un'opportuna QUANTITA' DI TAMPONE e la BEUTA viene messa all'INTERNO di un FORNO A MICROONDE o su una PIASTRA RISCALDATA in maniera tale da portare la SOLUZIONE a EBOLLIZIONE e consentire la SOLUBILIZZAZIONE del GEL. Quando il GEL viene posto all'interno della BEUTA forma un CORPO DI FONDO , se si AGITA si ha una SOSPENSIONE. Solo in seguito al RISCALDAMENTO della SOLUZIONE questa diviene LIMPIDA perché l'AGAROSIO viene perfettamente SOLUBILIZZATO. A questo punto si può VERSARE il GEL all'interno di un VASSOIO dove un GEL può POLIMERIZZARE. Il VASSOIO è di PLASTICA e per fare in modo che sia a TENUTA viene posto dello SCOTCH alle ESTREMITA' in maniera tale che quando si VERSA la SOLUZIONE questa NON FUORIESCE. Si versa la SOLUZIONE all'interno della VASCHETTA, si posiziona un PETTINE che forma i POZZETTI all'interno dei quali si CARICA il CAMPIONE e si lascia il GEL a POLIMERIZZARE. La POLIMERIZZAZIONE è molto più veloce in INVERNO dal momento che il GEL si RAFFREDDA più VELOCEMENTE (più lenta in estate). Una volta che il GEL è POLIMERIZZATO, il gel ritorna ad essere OPACO, si TOGLIE il PETTINE e si osservano tutti PICCOLI POZZETTI dove si andrà a CARICARE il CAMPIONE. Il GEL si prepara in ORIZZONTALE e non verticale tra le due lastrine. Si RIMUOVE lo SCOTCH e si può CARICARE il CAMPIONE. In alternativa all'uso dello scotch si possono utilizzare dei SUPPORTI dove ci sono dei GOMMINI che fanno da TENUTA da entrambe le parti della vaschetta dove si va a colare il gel. Ci sono delle SCANALATURE sui LATI della VASCHETTA e in queste va POSIZIONATO il PETTINE in maniera tale che sia perfettamente DRITTO. Ci sono più scanalature che consentono di mettere anche due pettini all'interno dello stesso gel. Se si deve caricare una maggiore quantità di campione e non c'è bisogno di fare corse elettroforetiche molto lunghe ma è un gel molto veloce di screening dove il campione ha solo una molecola di DNA (es. prodotto di amplificazione da PCR) si possono mettere due pettini e caricare il doppio dei campioni. La CORSA ELETTROFORETICA va INTERROTTA PRIMA che i CAMPIONI che si trovano nella PRIMA PARTE del GEL raggiungano la SECONDA PARTE. Il CAMPIONE è COLORATO perché viene MISCELATO PRIMA della CARICA con un SAMPLE BUFFER. Il SAMPLE BUFFER o LOADING DYE contiene il GLICEROLO che AUMENTA la DENSITA' del CAMPIONE in maniera tale che, quando si va a CARICARE il CAMPIONE nel POZZETTO, NON FUORIESCE e NON CONTAMINA i POZZETTI ADIACENTI. Poi contiene dei COLORANTI che possono essere BLU DI BROMOFENOLO o BLU DI XILENCIANOLO. Il BLU DI BROMOFENOLO migra in corrispondenza di molecole di DNA di 500 pb in un GEL all'1.5% di AGAROSIO mentre il BLU DI XILENCIANOLO è una molecola più grande e MIGRA in corrispondenza di molecole di DNA di 4000 pb. Seguendo la migrazione di questi coloranti nel gel si ha un'idea di come sta procedendo la corsa elettroforetica e di quando si può eventualmente fermarla. I CAMPIONI vengono CARICATI con una PIPETTA nei POZZETTI mantenendo il GEL in posizione ORIZZONTALE. Il GEL viene posto in una CAMERETTA in cui si corre l'elettroforesi e la CARICA del CAMPIONE va fatta con il GEL IMMERSO nel TAMPONE DI CORSA quindi anche i pozzetti sono pieni del tampone. Nel momento in cui si CARICA il CAMPIONE che contiene GLICEROLO esso si DEPOSITA sul FONDO del POZZETTO immediatamente. Si mette il COPERCHIO sulla CAMERA ELETTROFORETICA collegando il POLO POSITIVO e il POLO NEGATIVO all'ALIMENTATORE. Il GEL è posizionato in una determinata maniera nella CAMERA ELETTROFORETICA. I POZZETTI sono dalla parte del POLO NEGATIVO dal momento che il DNA carico negativamente deve MUOVERSI verso il POLO POSITIVO. Al contrario il DNA migra sempre verso il polo positivo ma invece di entrare nel gel esce fuori

Answer 27

Il TAMPONE che si utilizza può essere - TAE: TRIS ACETATO EDTA, meno costoso - TBE: TRI BORATO EDTA, migliore capacità tamponante e migliore risoluzione

Answer 28

Bisogna utilizzare un COLORANTE che è una MOLECOLA FLUORESCENTE che si INTERCALA con la doppia molecola di DNA. Il COLORANTE più utilizzato è il BROMURO DI ETIDIO. E' un colorante fluorescente che ASSORBE la LUCE UV a 300 nm ed ha un colore GIALLO-ARANCIO. Quando si va a visualizzare il DNA sul gel si vede il DNA che spicca come una BANDA colorata in ARANCIO su FONDO SCURO. Il bromuro di etidio si va a intercalare nella doppia elica del DNA. Per questo è una molecola tossica a lungo termine e può provocare il cancro

Answer 29

Il BROMURO DI ETIDIO è stato SOSTITUITO con MOLECOLE che hanno la STESSA EFFICACIA e che NON sono PERICOLOSE. Queste molecole sono il GEL RED e il GEL GREEN. Il GEL RED e il BROMURO DI ETIDIO hanno lo STESSO SPETTRO DI ASSORBIMENTO. Il GEL GREEN ha anche il vantaggio di essere ECCITABILE dalla LUCE VISIBILE quindi può essere usato a LUNGHEZZE D'ONDA DIVERSE rispetto a quelle dell'etidio bromuro e del GEL RED che assorbono nell'ULTRAVIOLETTO. Il GEL ha una SENSIBILITA' MAGGIORE, consente di avere un SEGNALE a PARITA' DI GEL PIU' ALTO con un BACKGROUND PIU' BASSO. Mentre l'etidio bromuro tende a legarsi alla matrice e quindi le bande non spiccano più di tanto perché il fondo del gel tende a fluorescere, il GEL RED lascia il FONDO molto più SCURO. Il GEL è posizionato su un TRANS ILLUMINATORE che è l'apparecchio sul quale al termine della corsa elettroforetca si posiziona il gel, si ACCENDE la LAMPADA UV che sta SOTTO allo SCHERMO. Questa LAMPADA EMETTE una RADIAZIONE che viene ASSORBITA dal GEL RED o dall'ETIDIO BROMURO e questo consente di VISUALIZZARE le BANDE DI DNA sul GEL come delle BANDE ARANCIONI su FONDO SCURO. Si può fare una foto al gel in modo tale da conservare il risultato dal momento che le bande dopo un po' tendono a sbiadire

Answer 30

Si può determinare la DIMENSIONE delle MOLECOLE di DNA direttamente sul GEL costruendo una RETTA DI TARATURA. Ci sono una serie di MARCATORI DI PESO MOLECOLARE, si calcola il FATTORE DI RITARDO o la DISTANZA DI MIGRAZIONE di ciascuna delle BANDE dal TOP del gel. Si mette la DISTANZA DI MIGRAZIONE in GRAFICO rispetto al LOGARITMO DELLA DIMENSIONE dei FRAMMENTI e si costruisce la RETTA. La DISTANZA DI MIGRAZIONE è messa direttamente in relazione alla DIMENSIONE dei FRAMMENTI in pb ma la RELAZIONE non è lineare, è una CURVA, una PARABOLA. Mentre la relazione è lineare solo con il logartimo del PM, l'equazione della retta è D= a - b logPM dove il coefficiente angolare è negativo e la pendenza della retta è inversa quindi a una MAGGIORE DIMENSIONE corrisponde una MINORE MIGRAZIONE all'interno del gel

Answer 31

La FORMA del DNA va ad INTERFERIRE con la sua MIGRAZIONE poiché esistono anche DNA CIRCOLARI come i plasmidi batterici, quindi NON si può APPLICARE la DIRETTA RELAZIONE fra la DISTANZA DI MIGRAZIONE e la DIMENSIONE DEL DNA. Quando si realizzano delle ESTRAZIONI di DNA PLASMIDICO da CELLULE BATTERICHE e si va a SEPARARE ELETTROFORETICAMENTE il DNA si vedono in genere TRE BANDE o qualcuna in più. Sono diverse FORME in cui è presente il DNA PLASMATICO e alle quali corrisponde una VELOCITA' DI MIGRAZIONE DIFFERENTE. Si tratta dello stesso DNA che può migrare in maniera diversa. La FORMA PIU' VELOCE è quella del DNA SUPERAVVOLTO perché è una STRUTTURA GLOBULARE MOLTO COMPATTA e risulta avere la MINORE FORZA FRIZIONALE che si OPPONE al suo MOVIMENTO. Dopo di questo c'è il PLASMIDE LINEARIZZATO cioè quello che ha un DOPPIO NICK (discontinuità in un dsDNA in cui non vi è alcun legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti di un filamento) che MIGRA PIU' LENTAMENTE del plasmide superavvolto. La FORMA che MIGRA PIU' LENTAMENTE di tutte è quella che presenta UN NICK. Per cui c'è un TAGLIO solo su UNO dei due FILAMENTI, questo comporta lo SVOLGIMENTO di questo PLASMIDE SUPERAVVOLTO e questa FORMA CIRCOLARE è quella PIU' LENTA di tutte. L'unica FORMA che MIGRA in corrispondenza del MARCATORE del CORRETTO PM è la FORMA LINEARIZZATA cioè quella del DNA A DOPPIO FILAMENTO

Answer 32

L'RNA è una molecola a SINGOLO FILAMENTO che può RIPIEGARSI su se stessa e può formare delle STRUTTURE AD ANSA, dei LOOP quindi delle STRUTTURE A FORCINA. Se ci sono delle ZONE DI COMPLEMENTARITA' all'interno della stessa molecola queste si possono APPAIARE. Di conseguenza per SEPARARE delle molecole di RNA su GEL bisogna preparare dei GEL che mantengono l'RNA in FORMA DENATURATA quindi che IMPEDISCONO la FORMAZIONE di queste STRUTTURE SECONDARIE. All'interno del SAMPLE BUFFER in cui si va a SOLUBILIZZARE il CAMPIONE si aggiunge anche la FORMALDEIDE e la FORMAMMIDE. Sono degli AGENTI DENATURANTI. Il CAMPIONE prima della carica viene RISCALDATO a 65°C, in questa maniera si ROMPE qualsiasi FORMA SECONDARIA possa avere. La maggior parte dell'RNA ESTRATTO da una cellula è RNA RIBOSOMIALE quindi è questo che si visualizza sul GEL. In particolare si visualizzano DUE BANDE: una è l'RNA 28s e l'altro è l'RNA 18Ss. La BANDA 28s ha un'INTENSITA' pari almeno al DOPPIO rispetto a quella del 18s. Il 5s NON si riesce a VEDERE. Se invece si visualizza una STRISCIA SENZA DUE BANDE DEFINITE, si può BUTTARE l'RNA e rifare una NUOVA ESTRAZIONE dal momento che è indice di DEGRADAZIONE. Una STRISCIATA corrisponde a TANTE BANDE di PM DIVERSO che NON riescono a FOCALIZZARE bene sul GEL e MIGRANO in maniera DIFFUSA. C'è una NUVOLETTA FINALE che indica un'ELEVATA PRESENZA di FRAMMENTI di BASSISSIMO PM (30-40 basi). L'RNA è una molecola estremamente DELICATA, tende a DEGRADARSI molto facilmente perché le RNasi che sono gli enzimi che idrolizzano l'RNA sono sempre attive e quindi è molto facile che una preparazione di RNA possa degradarsi

Answer 33

Ci possono essere dei casi particolari in cui il GEL DI POLIACRILAMIDE deve essere UTILIZZATO: quando bisogna SEPARARE ACIDI NUCLEICI MOLTO PICCOLI e che DIFFERISCONO di POCHISSIMO per quanto riguarda la DIMENSIONE. I GEL DI SEQUENZA DI DNA dove si CARICANO dei FRAMMENTI di DNA che DIFFERISCONO tra loro solo per UNA BASE e quindi il PM è circa 360 Da su un GEL DI AGAROSIO NON si riuscirebbero a SEPARARE perché migrerebbero come un'UNICA BANDA. Invece una SEPARAZIONE COSI' PRECISA può essere realizzata utilizzando il GEL DI POLIACRILAMIDE. In questo caso la POLIACRILAMIDE viene utilizzata a delle PERCENTUALI MOLTO ELEVATE al 5-7% di quelle che si utilizzano per le proteine

Answer 34

L'AGAROSIO è il supporto di elezione per SEPARARE il DNA A DOPPIO FILAMENTO e RNA abbastanza GRANDI di DIMENSIONI SUPERIORI a 1Kb (mRNA, rRNA). Se si vogliono SEPARARE RNA MOLTO PICCOLI (siRNA, miRNA) di 40-50 BASI o dei DNA A SINGOLO FILAMENTO (oligonucleotidi) oppure si vogliono fare dei GEL DI SEQUENZA si utilizzano i GEL DI POLIACRILAMIDE. Le condizioni DENATURANTI di corsa si devono utilizzare in caso di MOLECOLE A SINGOLO FILAMENTO perché la condizione denaturante consente di EVITARE la FORMAZIONE di STRUTTURE SECONDARIE e ottenere una MIGLIORE SEPARAZIONE delle MOLECOLE

Answer 35

I CAPILLARI sono di QUARZO FUSO con un DIAMETRO INTERNO di 0.025-0.2 mm con una LUNGHEZZA VARIABILE di 30-100 cm. Questi CAPILLARI si distinguono in DUE TIPI 1. UNCOATED: NUDI in cui la PARETE INTERNA NON ha alcun RIVESTIMENTO. Sono caratterizzati da un notevole FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO che è dovuto alla presenza di CARICHE NEGATIVE che sono presenti sulla PARETE INTERNA del capillare e determinano una particolare MIGRAZIONE delle MOLECOLE CARICHE. 2. COATED: RIVESTITI di POLIMERI che possono essere anche di POLIACRILAMIDE che tendono a NEUTRALIZZARE le CARICHE NEGATIVE presenti sulla PARETE INTERNA del capillare quindi NON subiscono l'effetto del FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO

Answer 36

I CAPILLARI sono costituiti da QUARZO che è caratterizzato dalla presenza di GRUPPI SILANOLICI (composti contenenti almeno un atomo di silicio legato direttamente a un gruppo ossidrile) sul vetro CARICHI NEGATIVAMENTE. Sono fissati sulla PARETE INTERNA del CAPILLARE quindi quando si applica una DIFFERENZA DI POTENZIALE tra il POLO NEGATIVO e il POLO POSITIVO, questi IONI NEGATIVI tenderebbero a MIGRARE verso il POLO POSITIVO. In effetti NON possono MIGRARE perché sono BLOCCATI sulla PARETE INTERNA del capillare e questo determina un FLUSSO verso il POLO NEGATIVO di CONTROIONI che possono essere dei CATIONI con la loro SFERA DI IDRATAZIONE oppure gli stessi IONI OSSONIO H3O+ creando un FLUSSO D'ACQUA. C'è un FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO, un FLUSSO NETTO DI IONI POSITIVI verso il CATODO che tende a trainare verso questo ELETTRODO tutte le MOLECOLE CARICHE

Answer 37

L'effetto del FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO è quello di - ACCELERARE il MOVIMENTO dei CATIONI che tendono a muoversi verso il CATODO - RITARDARE il MOVIMENTO degli ANIONI che tenderebbero a spostarsi verso l'ANODO ma si trovano CONTRASTATI nel MOVIMENTO dal FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO che li SPINGE nella DIREZIONE OPPOSTA quindi sono rallentati, - FAVORIRE il MOVIMENTO delle SPECIE NEUTRE che di norma NON si MUOVEREBBERO sotto l'azione di un campo elettrico invece si MUOVONO sospinte dal FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO. Di norma questo EFFETTO può essere TRASCURATO perché la maggior parte dei SUPPORTI sono RIVESTITI da POLIMERI (agarosio, gel di poliacrilamide) però qualora si volesse VALUTARE il FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO sulla VELOCITA' DI MIGRAZIONE DELLE PARTICELLE CARICHE si può misurare nello STESSO SISTEMA la MIGRAZIONE di MOLECOLE ELETTRICAMENTE NEUTRE che di norma non si muoverebbero e il loro MOVIMENTO è solo determinato dal FLUSSO ELETTROENDOSMOTCIO. Questo effetto può essere TRASCURATO a meno di una ELETTROFORESI CAPILLARE con dei CAPILLARI NON RIVESTITI (uncoated)

Answer 38

Tutte le CARICHE ELETTRICHE tendono a muoversi verso il CATODO. L'entità del flusso elettroendosmotico è di numerosi ordini di grandezza maggiore rispetto alla mobilità elettroforetica delle proteine. I CATIONI hanno una loro MOBILITA' ELETTROFORETICA che li spinge verso il CATODO a cui si aggiunge il FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO. Quindi la MOBILITA' ELETTROFORETICA APPARENTE non è quella reale del catione ma quella INDOTTA anche dal FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO ed è data dalla SOMMA di queste MOBILITA': i CATIONI risultano essere ACCELERATI. Le MOLECOLE NEUTRE non dovrebbero muoversi ma la loro MOBILITA' ELETTROFORETICA APPARENTE corrisponde a quella del FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO. Gli ANIONI hanno una MOBILITA' ELETTROFORETICA OPPOSTA a quella del FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO. La MOBILITA' degli ANIONI è sempre diretta verso il CATODO ma si deve SOTTRARRE al FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO la MOBILITA' ELETTROFORETICA che spingerebbe normalmente gli ANIONI verso il POLO POSITIVO. Quindi TUTTE le MOLECOLE tendono a muoversi verso il CATODO. I CATIONI con ELEVATO RAPPORTO CARICA/MASSA sono quelli che si MUOVONO PIU' VELOCEMENTE, dopo ci sono i CATIONI con un RAPPORTO CARICA/MASSA più BASSO seguiti dalle SPECIE NEUTRE. Gli ANIONI con BASSO RAPPORTO CARICA/MASSA si muoveranno più VELOCEMENTE verso il CATODO e per ULTIMI ci sono gli ANIONI con ELEVATO RAPPORTO CARICA/MASSA che tenderebbero ad andare verso l'anodo ma il FLUSSO ELETTROENDOSMOTICO li spinge verso il CATODO

Answer 39

La CARICA del CAMPIONE avviene in corrispondenza dell'ANODO in modo che tutte le MOLECOLE possano SPOSTARSI verso il CATODO. Il RILEVAMENTO della MOLECOLA avviene in corrispondenza di questo ELETTRODO. Per realizzare un'ELETTROFORESI CAPILLARE bisogna IMMERGERE un'ESTREMITA' del CAPILLARE in CONTENITORI contenenti il BUFFER, in un contenitore c'è l'anodo e in un altro il catodo. Il MOVIMENTO va dal POLO POSITIVO AL POLO NEGATIVO. Il RILEVATORE è posto in PROSSIMITA' del POLO NEGATIVO e consente il RILEVAMENTO di tutte le MOLECOLE che PASSANO all'interno di questa CELLA DETECTION. Per AUMENTARE la SENSIBILITA' del RILEVATORE è possibile avere un MAGGIORE CAMMINO OTTICO, quindi un AMPLIAMENTO del DIAMETRO del CAPILLARE in corrispondenza del PUNTO DI RILEVAMENTO in quanto dalla legge di Lambert-Beer il cammino ottico è direttamente proporzionale all'assorbimento. Quindi se si aumenta il cammino ottico del rilevatore si può ottenere un assorbimento maggiore e quindi rendere il sistema più sensibile. La ZONA del CAPILLARE in corrispondenza del RILEVATORE risulta essere SCOPERTA per consentire alla RADIAZIONE che permette il rilevamento delle molecole cariche che passano attraverso questa zona del capillare di RAGGIUNGERE il LIQUIDO INTERNO al CAPILLARE. Alcuni RILEVATORI si basano sulla DETERMINAZIONE DELLA FLUORESCENZA quindi viene sfruttata la proprietà di emettere una radiazione fluorescente delle molecole per poterle evidenziare oppure altri si basano sulla CONDUTTIVITA' quindi viene rilevato il passaggio di una molecola carica attraverso questa porzione del capillare. Spesso i sistemi di elettroforesi capillari sono interfacciati con degli spettrometri di massa. L'OUTPUT di un'elettroforesi capillare è sotto forma di PICCHI e ad ogni PICCO corrisponde il PASSAGGIO di una MOLECOLA CARICA attraverso la zona del RILEVATORE. ELETTROFEROGRAMMA: risultato di un sistema di sequenziamento del DNA. Ad ognuno dei picchi corrisponde una specifica base

Answer 40

Può avvenire secondo due modalita' 1. ELETTROCINETICA: le ESTREMITA' del CAPILLARE devono pescare in VASCHETTE contenenti il TAMPONE DI CORSA ma nel momento in cui bisogna INIETTARE il CAMPIONE all'interno del capillare, l'ESTREMITA' ANODICA del CAPILLARE viene inserita all'interno della SOLUZIONE DEL CAMPIONE, si applica una DIFFERENZA DI POTENZIALE per un tempo brevissimo così da fare in modo che il CAMPIONE possa ENTRARE nel CAPILLARE e a questo punto l'ESTREMITA' ANODICA del CAPILLARE viene TOLTA dalla SOLUZIONE contenente il CAMPIONE, viene IMMERSA nella SOLUZIONE contenente il TAMPONE e si avvia il PROCESSO ELETTROFORETICO 2. A PRESSIONE: l'ESTREMITA' ANODICA del CAPILLARE viene posta in un CONTENITORE dove è presente il CAMPIONE che viene inserito all'interno del CAPILLARE grazie all'applicazione di un'ELEVATA PRESSIONE nella SOLUZIONE. Viene spinta all'interno del CAPILLARE. A questo punto si avvia il PROCESSO ELETTROFORETICO trasferendo l'ESTREMITA' ANODICA del CAPILLARE all'interno del BUFFER contenente il TAMPONE

Answer 41

Gli ELETTROFEROGRAMMI sono delle interpretazioni del risultato molto semplici e dirette dal momento che ad ogni PICCO corrisponde una MOLECOLA CARICA che è passata attraverso la ZONA DI RILEVAMENTO del CAPILLARE. Inoltre, il fatto che il CAPILLARE sia STRETTO e LUNGO SFAVORISCE la formazione di CORRENTI CONVETTIVE quindi anche l'EFFETTO JOULE è notevolmente più BASSO. Questo ELEVATO RAPPORTO SUPERFICIE/VOLUME del CAPILLARE consente un'ottima DISSIPAZIONE del CALORE cosicché l'EFFETTO JOULE si fa sentire di meno dal momento che si ha un MINORE AUMENTO della TEMPERATURA. Per tenere sotto controllo la temperatura ci sono degli ottimi sistemi di refrigerazione. Richiede una PICCOLISSIMA QUANTITA' di CAMPIONE e di REAGENTI. La METODICA può essere facilmente AUTOMATIZZATA

Answer 42

Consente di SEPARARE le PROTEINE in relazione alla loro CARICA ed è utilizzato anche per la DETERMINAZIONE del PUNTO ISOELETTRICO di una proteina. Le PROTEINE vengono SEPARATE all'interno di un GEL in cui è stato creato in GRADIENTE DI pH. Le molecole cariche sotto l'azione di un campo elettrico cominciano a muoversi, ma quando raggiungono la regione del supporto dove il pH CORRISPONDE al loro PUNTO ISOELETTRICO, la loro CARICA NETTA risulta essere pari a 0 e la MOLECOLA si FERMA in quel punto, Anche se il processo elettroforetico viene protratto per tempi più lunghi la proteina non si può muovere perché la sua carica netta è pari a 0

Answer 43

- Se una PROTEINA viene posta ad un pH INFERIORE al proprio PUNTO ISOELETTRICO si CARICA POSITIVAMENTE - Se una PROTEINA viene posta ad un pH SUPERIORE al proprio PUNTO ISOELETTRICO si CARICA NEGATIVAMENTE E' un sistema che consente di separare le proteine in funzione del punto isoelettrico ma se si utilizzano dei MARCATORI DI PUNTO ISOELETTRICO NOTO che si SEPARANO contestualmente alle PROTEINE DI INTERESSE nel sistema, si può determinare il PUNTO ISOELETTRICO delle PROTEINE DI INTERESSE sulla base della MIGRAZIONE dei MARCATORI

Answer 44

CLASSICA: utilizza delle molecole chiamate ANFOLITI MODERNA: utilizza le IMMOBILINE cioè GRADIENTI DI pH IMMOBILIZZATI

Answer 45

Si basa sull'utilizzo di ANFOLITI cioè MOLECOLE ANFOTERE che hanno PROPRIETA' ACIDE e BASICHE. Si tratta di ACIDI definiti POLIAMMINO POLICARBOSSILICI all'interno della STESSA MOLECOLA. In relazione al NUMERO di GRUPPI ACIDI e BASICI che queste molecole hanno, saranno caratterizzate da pka DIFFERENTI quindi avranno PUNTI ISOELETTRICI DIFFERENTI. E' su questi DIVERSI PUNTI ISOELETTRICI che si basa la formazione di questo GRADIENTE DI pH. Si immagina un supporto di GEL DI POLIACRILAMIDE A MAGLIE MOLTO LARGHE che deve fungere solo da SUPPORTO ma non da setaccio molecolare perché si devono separare le molecole in base al punto isoelettrico. Si pone all'ESTREMITA' del GEL una SOLUZIONE ACIDA all'ANODO e una SOLUZIONE BASICA al CATODO. Queste due soluzioni rappresentano gli ESTREMI ACIDO e BASICO del GRADIENTE. Queste soluzioni tendono ad entrare nel gel e consentono alle ANFOLINE di MIGRARE verso l'ANODO o verso il CATODO a seconda del loro PUNTO ISOELETTRICO. Le ANFOLINE sono libere di MUOVERSI nel GEL e andranno a FORMARE il GRADIENTE DI pH su tutta la LUNGHEZZA del SUPPORTO. Il GRADIENTE NON è STABILE per tantissimo tempo dal momento che le ANFOLINE sono molecole che possono DIFFONDERE anche all'interno della SOLUZIONE quindi il gradiente è stabile per brevi periodi

Answer 46

Le IMMOBILINE sono IMMOBILIZZATE all'interno del GEL. Non possono muoversi quindi si ha un GRADIENTE PIU' STABILE nel tempo. Le IMMOBILINE sono caratterizzate dalla presenza di GRUPPI ACIDI e BASICI quindi sono dotate di pka DIVERSI che conferiscono PUNTI ISOELETTRICI DIFFERENTI a queste molecole. La struttura delle immobiline è simile a quella dell'acrilamide. Il GRUPPO R delle IMMOBILINE può essere un GRUPPO AMMINICO o CARBOSSILICO quindi l'immobilina è una molecola tra l'acrilamide e le anfoline. Il vantaggio è che le IMMOBILINE possono POLIMERIZZARE insieme alle molecole di POLIACRILAMIDE quindi creare un GRADIENTE DI pH che è IMMOBILIZZATO. Le IMMOBILINE si INTERCALANO tra le molecole di POLIACRILAMIDE all'interno del GEL. Per creare questo GRADIENTE DI pH si utilizza un FORMATORE DI GRADIENTI formato da DUE BECKER collegati tramite un RUBINETTO che mette in connessione le DUE SOLUZIONI presenti nei contenitori. Nel primo contenitore c'è una SOLUZIONE ACIDA in diretto contatto attraverso un tubicino con le LASTRINE in cui si va a colare il GEL. Nel secondo contenitore c'è una SOLUZIONE BASICA che progressivamente va ad AUMENTARE il pH della SOLUZIONE ACIDA in maniera tale da CREARE il GRADIENTE. Si devono mettere le OPPORTUNE IMMOBILINE all'interno delle DUE SOLUZIONI in maniera tale da creare un GRADIENTE DI pH tra i DUE ESTREMI che sono stati FISSATI. La CONCENTRAZIONE DI ACRILAMIDE è MOLTO BASSA perché serve per formare il SUPPORTO e IMMOBILIZZARE il GRADIENTE (3-4% circa quella si un upper gel sds-page). Comunemente si possono trovare in commercio delle strips con dei gradienti immobilizzati chiamate IPG STRIPS ossia STRIPS PER GRADIENTI PER ISOELETTROFOCALIZZAZIONE. Vengono vendute in confezione singola, si conservano a -20 per mesi o anni e quando servono si reidratano e si possono utilizzare per l'ief. Il GRADIENTE DI pH LINEARE è quello dove il pH AUMENTA LINEARMENTE dall'ACIDO verso il BASICO. Tuttavia a seconda delle necessità si possono utilizzare dei GRADIENTI NON LINEARI. Il vantaggio di questi GRADIENTI A STEP è che se si sa di avere un DETERMINATO NUMERO DI PROTEINE in un RANGE DI pH RISTRETTO si può MIGLIORARE la SEPARAZIONE della PROTEINA APPIATTENDO il GRADIENTE dentro questo RANGE DI pH

Answer 47

Mette insieme DUE ELETTROFORESI, cioè l'ISOELETTROFOCALIZZAZIONE e l'SDS-PAGE. E' definita così in quanto le DUE ELETTROFORESI vengono condotte in DIREZIONE ORTOGONALE l'una rispetto all'altra. Il TUBICINO DI GEL con le varie BANDE corrispondenti alle PROTEINE SEPARATE in funzione del loro PUNTO ISOELETTRICO può essere posizionato su un GEL DI POLIACRILAMIDE POLIMERIZZATO su DUE LASTRINE. Può essere posto all'interfaccia tra le DUE LASTRINE in modo che sia a DIRETTO CONTATTO con l'SDS-PAGE che in questo caso è costituito solo dal LOWER GEL. In DIREZIONE ORTOGONALE a quella in cui è stata condotta l'IEF si realizza una SEPARAZIONE delle PROTEINE in funzione della MASSA. Quindi questo sistema mette insieme DUE DIFFERENTI MODALITA' DI SEPARAZIONE della proteina: 1. In funzione della CARICA in una DIMENSIONE 2. In funzione della MASSA nella direzione ORTOGONALE L'elettroforesi bidimensionale viene utilizzata per analizzare dei sistemi molto complessi di proteine come gli estratti proteici totali (analisi del proteoma). La PRIMA DIMENSIONE è quella che si realizza per IEF e la SECONDA DIMENSIONE consente una SEPARAZIONE per MASSA delle stesse PROTEINE GIA' SEPARATE per CARICA e viene condotta alla DIREZIONE ORTOGONALE alla precedente. Si prosegue con la COLORAZIONE del GEL in maniera tale da INDIVIDUARE le PROTEINE sul GEL e poi si IDENTIFICANO le PROTEINE DI INTERESSE. Questo sistema consente di avere una separazione molto migliore di campioni proteici molto complessi e viene utilizzato per fare l'analisi differenziale del proteoma di un campione

Answer 48

Nel momento in cui si deve realizzare un'elettroforesi bidimensionale con l'intento di fare un'analisi proteomica si devono ESTRARRE dal CAMPIONE TUTTE le PROTEINE che contiene cercando di NON PERDERNE nessuna. C'è un sistema che prende il nome di 2D QUANT-KIT cioè un kit di quantificazione specificamente mirato alla quantificazione di proteine estratte per realizzare delle analisi proteomiche dei gel bidimensionali. Questo kit si adatta molto bene ai sistemi di preparazione del campione per questo tipo di gel

Answer 49

- PRECIPITAZIONE CON AMMONIO SOLFATO - PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI: tutti i solventi organici tendono ad ABBASSARE la COSTANTE DIELETTRICA dell'ACQUA quindi a DIMINUIRE la SOLUBILITA' delle PROTEINE e a FAVORIRE la SOLUBILITA' delle PROTEINE IDROFOBICHE (precipitazione con TCA, precipitazione con acetone, precipitazione con TCA e acetone)

Answer 50

Si deve OMOGENEIZZARE il CAMPIONE e poi RISOSPENDERLO IN SOLUZIONE che contiene il 10% di TCA/ACETONE in presenza di AGENTI RIDUCENTI come BETA MERCAPTOETANOLO o DTT. Il CAMPIONE viene poi riposto in un CONGELATORE per 3/4 D'ORA e poi si raccolgono le PROTEINE PRECIPITATE mediante CENTRIFUGAZIONE. Si LAVA il PELLET con l'ACETONE e in presenza di AGENTI RIDUCENTI per un PAIO di VOLTE (lavare: risospendere il pellet, centrifugare e rimuovere il supernatante) lo si lascia ASCIUGARE all'ARIA finché il SOLVENTE ORGANICO EVAPORA. Il passaggio successivo è quello di RISOSPENDERE le PROTEINE perché bisogna CARICARLE sul GEL ELETTROFORETICO e quindi si devono RIPORTARE in SOLUZIONE

Answer 51

Si utilizzano dei TAMPONI DI SOLUBILIZZAZIONE abbastanza DRASTICI perché non è semplici riportare in soluzione delle proteine precipitate. I TAMPONI che vengono utilizzati presentano un'ELEVATA CONCENTRAZIONE DI UREA (8M). L'UREA è un AGENTE CAOTROPICO, favorisce la DENATURAZIONE delle PROTEINE e la SOLUBILIZZAZIONE e il RITORNO IN SOLUZIONE delle proteine. Talvolta l'urea si utilizza in combinazione con la tiourea che è un agente caotropico ancora più forte dell'urea stessa. Poi si utilizzano dei DETERGENTI NON CARICHI in quanto si deve realizzare un'elettroforesi bidimensionale per cui si devono SEPARARE in PRIMA DIMENSIONE le PROTEINE in funzione della CARICA quindi non si può alterare la carica delle proteine e non si può aggiungere alle proteine un detergente come l'SDS dal momento che l'SDS andrà a caricarle negativamente e quindi si maschera la carica delle proteine. Si possono utilizzare altri tipi di DETERGENTI NON IONICI oppure ZWITTERIONICI quindi detergenti che non alterano la carica delle proteine. I DETERGENTI hanno la funzione di favorire la SOLUBILITA' delle PROTEINE in particolare delle PROTEINE IDROFOBICHE che in una soluzione acquosa non tornerebbero ad essere solubili. Il tampone di solubilizzazione contiene anche degli AGENTI RIDUCENTI che hanno la funzione di RIDURRE i PONTI DISOLFURO. Si aggiungono anche degli ANFOLITI che creano il GRADIENTE DI pH qualora si realizza un gradiente in condizioni classiche. Nel momento in cui si utilizzano delle immobiline quindi delle IPG strips gli anfoliti possono essere omessi

Answer 52

Utilizzando le IPG STRIPS si risparmia la fase di preparazione del gradiente di pH e i risultati dell'analisi sono molto più riproducibili. Si vanno a REIDRATARE le STRIPS di IMMOBILINE all'interno di un'opportuno BUFFER dopodiché si va a CARICARE il CAMPIONE sulle STRIPS che vengono poste su un APPARATO che consente la SEPARAZIONE in base alla CARICA delle proteine. Successivamente le IPG STRIPS vengono poste SOPRA un GEL DI ACRILAMIDE in presenza di SDS (sds-page) e la CORSA ELETTROFORETICA viene realizzata in DIREZIONE ORTOGONALE rispetto alla precedente. Tutte le PROTEINE che si racchiuderanno sotto un'UNICA BANDA perché avevano lo STESSO PUNTO ISOELETTRICO a questo punto possono essere SEPARATE in base al PM

Answer 53

Si possono realizzare dei gradienti meno ampi in modo da focalizzare l'interesse su specifici pH. In genere si parte da gradienti piuttosto larghi (es. 3-10, 4-9) e si ha una prima idea di come si presenta il campione. Se si nota che ci sono delle ragioni di pH dove si concentra una grande quantità di proteine, nella stessa dimensione del gel si può fare un gradiente di pH 4-5 quindi si va ad appiattire il gradiente e a risolvere meglio delle proteine che in un certo spazio erano più attaccate

Answer 54

I GEL al termine della corsa devono essere COLORATI e si possono COLORARE con COOMASSIE (coomassie colloidale: vantaggio nella colorazione, sensibilità non molto alta). Ci sono dei COLORANTI PIU' SENSIBILI come il SILVER STAIN (idrato d'argento) oppure la COLORAZIONE con ZINCO o dei COLORANTI FLUORESCENTI che hanno una SENSIBILITA' MAGGIORE e sono tutti COMPATIBILI con l'analisi di SPETTROMETRIA DI MASSA che quando si parla di analisi proteomica è la prosecuzione dell'indagine

Answer 55

Per ELABORARE le MAPPE si utilizzano dei SOFTWARE che individuano i vari SPOT, li NUMERANO e consentono di SOVRAPPORRE MAPPE provenienti da DUE TESSUTI DIFFERENTI o trattate in MANIERA DIFFERENTE per fare l'analisi differenziale. Tramite l'aiuto di un robot, gli SPOT di MAGGIORE INTERESSE possono essere TAGLIATI dal GEL, ANALIZZATI per SPETTROMETRIA DI MASSA, in maniera tale da IDENTIFICARE la PROTEINA DI INTERESSE

Answer 56

E' una tecnica utilizzatissima in laboratorio e consente di IDENTIFICARE una SPECIFICA PROTEINA DI INTERESSE all'interno di una MISCELA DI PROTEINE. BLOTTING significa TRASFERIMENTO SU MEMBRANA quindi IMMOBILIZZAZIONE delle PROTEINE su una MEMBRANA in maniera tale che le PROTEINE possano essere utilizzate mediante l'utilizzo di ANTICORPI

Answer 57

- SOUTHERN: consiste nel TRASFERIMENTO DI DNA sulla MEMBRANA e nell'utilizzo di una SONDA per IDENTIFICARE un DNA DI INTERESSE - NORTHERN: consiste nel TRASFERIMENTO DI RNA su MEMBRANA e nell'utilizzo di una SONDA per IDENTIFICARE un RNA DI INTERESSE - WESTERN: consiste nel TRASFERIMENTO e nell'utilizzo di una SONDA di PROTEINA - EASTERN: sistema di TRASFERIMENTO per l'INDIVIDUAZIONE di MODIFICHE POST-TRADUZIONALI delle proteine

Answer 58

Tecniche come il SOUTH-WESTERN che consiste nell'IDENTIFICAZIONE di INTERAZIONI PROTEINA-DNA, il FAR-WESTERN che consente di INDIVIDUARE delle INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA e il FAR-EASTERN che consente di INDIVIDUARE dei LIPIDI

Answer 59

Nel western-blotting le PROTEINE vengono SEPARATE mediante ELETTROFORESI SU GEL (sds-page) per poi essere TRASFERITE su una MEMBRANA. Il vantaggio è quello di poter IDENTIFICARE in maniera SPECIFICA una PROTEINA DI INTERESSE. L'SDS-PAGE consente di identificare una proteina in base al PM. La CERTEZZA di aver individuato la PROTEINA DI INTERESSEcon l'SDS-PAGE si ha solo se si fa REAGIRE la PROTEINA con un ANTICORPO SPECIFICO per quella PROTEINA. A questo punto se si TRASFERISCONO le PROTEINE dell'SDS-PAGE su una MEMBRANA DI NITROCELLULOSA, si fa una SPECIFICA REAZIONE PROTEINA (antigene) con l'ANTICORPO e si vede che l'ANTICORPO RICONOSCE quella PROTEINA allora c'è un UNICO SEGNALE sulla MEMBRANA e si può essere SICURI che quella è la PROTEINA DI INTERESSE

Answer 60

Il primo passaggio è quello di effettuare una SEPARAZIONE delle PROTEINE mediante SDS-PAGE. Successivamente queste PROTEINE devono essere IMMOBILIZZATE attraverso un TRASFERIMENTO SU MEMBRANA. Le proteine devono essere immobilizzate perché in gel non sono fissate nelle maglie e se il gel viene messo in una soluzione acquosa le proteine possono fuoriuscire dal gel per questo il GEL viene COLORATO e FISSATO al TERMINE dell'ELETTROFORESI dal momento che la colorazione con coomassie o altri sistemi in presenza di soluzione acide determina la precipitazione delle proteine nel punto del gel in cui esse sono migrate ed evita che queste all'interno di una soluzione acquosa possano uscire dal gel. Se si colora un gel con coomassie difficilmente si può utilizzare quella proteina complessata con il colorante per altre analisi quindi se si devono fare altre analisi si devono immobilizzare su altri supporti le proteine. Questa IMMOBILIZZAZIONE si effettua TRASFERENDOLE su una MEMBRANA. A questo punto si procede con una SATURAZIONE della MEMBRANA con delle PROTEINE ASPECIFICHE dal momento che si deve IDENTIFICARE la PROTEINA DI INTERESSE con un ANTICORPO. L'ANTICORPO è una PROTEINA e la MEMBRANA su cui sono state TRASFERITE le PROTEINE è una membrana che ha proprietà di IMMOBILIZZARE le PROTEINE. Quindi se si fa INTERAGIRE immediatamente l'ANTICORPO con le PROTEINE che sono state trasferite questo ANTICORPO si può attaccare in maniera ASPECIFICA a tutti i SITI DISPONIBILI della MEMBRANA. Prima di procedere con l'incubazione e con l'anticorpo che riconosce la proteina di interesse, si va a IMMOBILIZZARE, BLOCCARE, SATURARE tutti i SITI che possono essere DISPONIBILI sulla membrana per l'ATTACCO DI PROTEINE con PROTEINE TOTALMENTE ASPECIFICHE come la BSA oppure PROTEINE DEL LATTE. A questo punto si può procedere con l'INCUBAZIONE dell'ANTICORPO diretto verso la PROTEINA DI INTERESSE. Per IDENTIFICARE il PUNTO in cui l'ANTICORPO si è LEGATO si realizza un'INCUBAZIONE con un ANTICORPO SECONDARIO che RICONOSCE il PRIMARIO e che presenta una SPECIFICA MARCATURA che consente di INDIVIDUARE la POSIZIONE dove l'ANTICORPO PRIMARIO si è LEGATO

Answer 61

Il TRASFERIMENTO viene realizzato utilizzando delle MEMBRANE. Le membrane possono essere MEMBRANE DI PVDF (POLIVINILDENFLUORURO) oppure MEMBRANE DI NITROCELLULOSA. In entrambi i casi le PROTEINE si LEGANO a queste MEMBRANE tramite delle INTERAZIONI IDROFOBICHE. Per quanto riguarda il PVDF, le MEMBRANE formano una sorta di RETICOLO con queste MOLECOLE tanto che possono esserci dei PORI sulla MEMBRANA di DIMENSIONI DIVERSE (0.45 µm oppure 0.22-1 µm). La DIMENSIONE di questi pori viene scelta in funzione della DIMENSIONE delle PROTEINE che bisogna TRASFERIRE. Per molecole tra 13 e 400 kDa si utilizzano MEMBRANE con PORI di DIAMETRO 0.45 µm, per PEPTIDI e MOLECOLE PIU' PICCOLE di 13000 Da si utilizzano MEMBRANE con PORI PIU' STRETTI. Le INTERAZIONI con la MEMBRANA sono essenzialmente IDROFOBICHE e in misura minore anche DIPOLO-DIPOLO dovute alla presenza degli ATOMI di FLUORO che sono molto ELETTRONEGATIVI. Per quanto riguarda la MEMBRANA DI NITROCELLULOSA, si ha una STRUTTURA POROSA della membrana. La NITROCELLULOSA è un ESTERE NITRICO della CELLULOSA quindi i GRUPPI OH della CELLULOSA sono SOSTITUITI con dei GRUPPI NITRATO. L'INTERAZIONE è IDROFOBICA e in misura minore intervengono delle INTERAZIONI ELETTROSTATICHE con i GRUPPI NITRATO. La DIFFERENZA principale fra le due MEMBRANE è che quelle di NITROCELLULOSA anche se sono più comunemente utilizzate risultano essere PIU' FRAGILI e SENSIBILI a SOLVENTI che possono essere utilizzati per APPLICAZIONI SUCCESSIVE. Inoltre, manifestano una SCARSA CAPACITA' a TRATTENERE PROTEINE con un BASSO PM quindi in questo caso si preferisce utilizzare la membrana in PVDF. La MEMBRANA IN PVDF risulta essere più PERFORMANTE per una serie di ATTIVITA' che possono essere svolte in SEGUITO al TRASFERIMENTO delle MEMBRANE su NITROCELLULOSA come la spettrometria di massa o il sequenziamento di Edman che serve per determinare la struttura primaria quindi la sequenza delle proteine. Il PVDF ha anche una MAGGIORE CAPACITA' DI LEGAME di PROTEINE (trattiene circa 100-200 µg/cm al quadrato contro gli 80-100 µg/cm al quadrato della nitrocellulosa)

Answer 62

Si deve allestire una sorta di SANDWICH in quanto si deve mettere a STRETTO CONTATTO la MEMBRANA con il GEL e consentire il PASSAGGIO delle PROTEINE sotto l'azione di un CAMPO ELETTRICO dal gel alla membrana. L'allestimento del sandwich parte dal POLO POSITIVO quindi dall'ANODO. Questo SANDWICH viene fornito ponendo prima una SPUGNETTA (in dotazione al sistema di allestimento dell'elettroblotting), SOPRA la spugnetta vengono posti UNO o DUE FOGLI DI CARTA DA FILTRO delle STESSE DIMENSIONI della SPUGNETTA, quindi viene posta la MEMBRANA e SOPRA la membrana viene posto il GEL, SOPRA il gel vengono posti dei FOGLI DI CARTA DA FILTRO e poi la SPUGNETTA. Si CHIUDE questo SANDWICH e si può realizzare l'elettroblotting. Si parte dall'ANODO e si finisce con la SPUGNETTA che sarà rivolta verso il POLO NEGATIVO (CATODO). La MEMBRANA è posizionata verso il POLO POSITIVO mentre il GEL verso il POLO NEGATIVO. Questa posizione è fondamentale dal momento che l'ELETTROBLOTTING viene realizzato dopo un SDS-PAGE. Nell'sds-page le proteine si caricano negativamente per la presenza dell'SDS, di conseguenza se una proteina è carica negativamente essa si muoverà verso il polo positivo (anodo). Di conseguenza è fondamentale che la membrana sia rivolta verso il polo positivo e il gel verso quello negativo perché se si INVERTE la POSIZIONE dei due le PROTEINE tenderanno a TRASFERIRSI sul FOGLIO DI CARTA DA FILTRO e ad essere PERSE all'interno del TAMPONE DI TRASFERIMENTO. Il TRASFERIMENTO può essere realizzato in FORMA WET dove il SANDWICH viene posto all'interno di una CAMERA ELETTROFORETICA completamente RIEMPITA di TAMPONE. Il SANDWICH è totalmente IMMERSO nel TAMPONE DI CORSA. C'è anche un sistema di TRASFERIMENTO definito SEMI DRY dove il SANDWICH NON è inserito in una CAMERETTA ripiena di tampone ma il TAMPONE è presente solo nei FOGLI DI CARTA DA FILTRO. Il SANDWICH viene posto tra DUE ELETTRODI di GRAFITE. Al TERMINE del TRASFERIMENTO la MEMBRANA viene RECUPERATA e sottoposta alle ALTRE FASI del WESTERN BLOTTING. Prima di procedere alle altre fasi per essere sicuri che il trasferimento sia avvenuto bene e che quindi ci siano effettivamente delle proteine sulla membrana, si può COLORARE quest'ultima con un COLORANTE chiamato ROSSO PONCEAU che interagisce con gli AA BASICI delle PROTEINE e COLORA le PROTEINE di ROSSO. E' un colorante che può essere RIMOSSO, non è un passaggio necessario ma può dare la sicurezza che le proteine siano state trasferite. Un altro sistema di SCREENING per essere sicuri che le proteine siano state trasferite è quello di COLORARE tramite COOMASSIE il GEL DOPO il TRASFERIMENTO. In questo caso NON ci dovrebbero essere MOLTE BANDE sul GEL perché le PROTEINE dovrebbero essere state TRASFERITE su NITROCELLULOSA. In genere le PROTEINE di ALTO PM sono quelle che si TRASFERISCONO MENO FACILMENTE tuttavia il WESTERN BLOTTING ha un sistema di DETECTION con ANTICORPI MOLTO SENSIBILE quindi bastano PICCOLISSIME QUANTITA' DI PROTEINE sulla MEMBRANA per poterle VISUALIZZARE. Il sistema SEMI DRY è indicato per il TRASFERIMENTO di PROTEINE INFERIORE ai 20 kDa che talvolta nel sistema wet possono essere PERSE nel corso del trasferimento dal momento che il trasferimento viene protratto per TEMPI MOLTO LUNGHI ed è possibile che proteine PICCOLE possano NON rimanere STRETTAMENTE LEGATE alla MEMBRANA e FUORIUSCIRE nel TAMPONE

Answer 63

E' composto da da TRIS e GLICINA nella STESSA CONCENTRAZIONE in cui si prepara il tampone per l'SDS-PAGE, ma è presente un 20% di METANOLO. Il METANOLO tende a RIMUOVERE l'SDS dalle PROTEINE per cui DECRESCE la MOBILITA' ELETTROFORETICA perché il TRASFERIMENTO avviene dal POLO NEGATIVO al POLO POSITIVO perché le PROTEINE sono CARICHE NEGATIVAMENTE. RIMUOVERE l'SDS favorisce l'INTERAZIONE IDROFOBICA delle PROTEINE con la MEMBRANA. Al contempo il METANOLO tende a RIDURRE la DIMENSIONE dei PORI del GEL cosicché le PROTEINE di ALTO PM possono essere TRASFERITE in maniera MENO PERFORMANTE. Basta comunque una PICCOLA QUANTITA' di PROTEINA sia TRASFERITA sul GEL che si può rivelare la sua PRESENZA tramite l'ANTICORPO

Answer 64

E' la SATURAZIONE di TUTTI gli altri SITI della MEMBRANA nei quali NON sono presenti PROTEINE. Si utilizzano delle PROTEINE ASPECIFICHE come latte scremato in polvere che viene solubilizzato e BSA. Questa SATURAZIONE della membrana IMPEDISCE all'ANTICORPO PRIMARIO di LEGARSI ASPECIFICAMENTE a SITI che NON SONO quelli dove è presente la PROTEINA DI INTERESSE

Answer 65

Gli ANTICORPI PRIMARI sono delle IMMUNOGLOBULINE, delle PROTEINE che sono SPECIFICHE per il RICONOSCIMENTO di un ANTIGENE, in questo caso la proteina di interesse, e sono MOLTO SENSIBILI. Piccole quantita' di proteine possono essere rilevate dall'anticorpo

Answer 66

Riconoscono PIU' EPITOPI (punti dell'antigene che riconoscono l'anticorpo) dell'ANTIGENE. Si realizza un'IMMUNIZZAZIONE RIPETUTA di un'ANIMALE (topo, coniglio, pollo) con l'ANTIGENE (proteina di interesse, peptide di questa proteina). Si PRELEVA il SANGUE nel momento del PICCO DI PRODUZIONE dell'ANTICORPO che viene PURIFICATO dal SIERO. Gli anticorpi policlonali RICONOSCONO PIU' EPITOPI dal momento che quando l'animale viene immunizzato la PROTEINA viene DEGRADATA, vengono prodotti PEPTIDI della proteina e si formano ANTICORPI contro EPITOPI DIFFERENTI. Non comporta il sacrificio degli animali (procedura più semplice)

Answer 67

Riconoscono un SOLO EPITOPO. Si parte con l'IMMUNIZZAZIONE dei TOPI che vengono SACRIFICATI per PRELEVARE la MILZA e prendere i LINFOCITI B che sono le CELLULE che producono gli ANTICORPI. Queste CELLULE vengono rese IMMORTALI mediante la FUSIONE con delle CELLULE TUMORALI (cellule di viroma) e si formano gli IBRIDOMI. I LINFOCITI T vengono PIASTRATI e SCREENATI per individuare i LINFOCITI B che producono ANTICORPI DIRETTI contro la PROTEINA DI INTERESSE. Si fanno dei TEST ELYSA in cui le PIASTRE presentano l'ANTIGENE DI INTERESSE e si va a vedere quale è il POZZETTO REATTIVO all'ANTICORPO. In questo modo si producono degli anticorpi monoclonali cioè che RICONOSCONO SPECIFICAMENTE un ANTIGENE (procedura più lunga e laboriosa)

Answer 68

Si utilizzano degli ANTICORPI POLICLONALI o MONOCLONALI per andare ad individuare nel pool di proteine sulla membrana se è PRESENTE e QUALE E' la PROTEINA DI INTERESSE. A questo punto si deve individuare la POSIZIONE nella MEMBRANA in cui l'ANTICORPO si è LEGATO. Si utilizza un ANTICORPO SECONDARIO che è un anticorpo che riconosce la PORZIONE COSTANTE dell'ANTICORPO PRIMARIO. Se l'ANTICORPO PRIMARIO è SPECIFICO per una particolare PROTEINA, l'ANTICORPO SECONDARIO è ASPECIFICO dal momento che riconosce MOLTI ANTICORPI PRIMARI. Questo ANTICORPO SECONDARIO viene PRODOTTO in una SPECIE DIVERSA da quella di PRODUZIONE dell'ANTICORPO PRIMARIO (goat-antimouse, goat-antirabbit). Gli ANTICORPI SECONDARI sono CONIUGATI con un ENZIMA in maniera tale che se si fornisce all'ENZIMA il proprio SUBSTRATO si consente lo SVILUPPO di una REAZIONE ENZIMATICA che di norma porta alla formazione di un CROMOFORO che si può RILEVARE direttamente sulla MEMBRANA

Answer 69

Gli ENZIMI con cui vengono CONIUGATI gli ANTICORPI SECONDARI sono: - FOSFATASI ALCALINA (AP): CONVERTE un SUBSTRATO INCOLORE chiamato 5BROMO 4CLORO INDOLOFOSFATO (BCIP) in un PRODOTTO di colore BLU. Si sviluppa una BANDA BLU sulla NITROCELLULOSA o sul PVDF. E' più utilizzata nelle piante in quanto negli animali può dare cross-reazione perché è presente in maniera abbondante in tutti i tessuti - PEROSSIDASI DA RAFANO (HRP): in presenza di ACQUA OSSIGENATA OSSIDA il 4CLORO 1NAFTOLO in un PRODOTTO INSOLUBILE BLU-GRIGIASTRO oppure il 3AMMINO 9ETIL CARBAZOLO (AEZ) in un PRODOTTO INSOLUBILE MARRONE oppure si utilizza il LUMINOLO come SUBSTRATO per produrre LUCE. E' isolata dalle piante ed è più utilizzata negli animali per evitare problemi di cross-reazione - SISTEMA BIOTINA/AVIDINA: è un'interazione molto sfruttata dal momento che l'AVIDINA è una PROTEINA che ha un'enorme AFFINITA' per la BIOTINA. L'AVIDINA è una GLICOPROTEINA presente nell'albume dell'uovo e la BIOTINA è una VITAMINA definita B7 o H. L'avidina viene definita così proprio per l'avidità di legame che ha per la biotina. Questa sistema viene molto utilizzato per ottenere delle AMPLIFICAZIONI DEL SEGNALE, cioè dei segnali più forti rispetto a quelli che si avrebbero utilizzando ANTIGENE-ANTICORPO PRIMARIO e SECONDARIO. L'ANTIGENE è IMMOBILIZZATO sulla PROTEINA. Si utilizza un ANTICORPO PRIMARIO BIOTINILATO che RICONOSCE l'ANTIGENE. A questo punto si fa REAGIRE il SISTEMA con l'AVIDINA che si LEGA in maniera MOLTO SPECIFICA alla BIOTINA. Ogni molecola di AVIDINA ha 4 SITI DI LEGAME per la BIOTINA. Di conseguenza rimangono 3 SITI LIBERI per l'INTERAZIONE con la BIOTINA che può essere CONIUGATA ad uno SPECIFICO ENZIMA che può essere una PEROSSIDASI DA RAFANO e in questa maniera per ogni ANTICORPO che ha INTERAGITO con l'ANTIGENE si ha un SEGNALE TRE VOLTE MAGGIORE rispetto a quello che si avrebbe in condizioni normali

Answer 70

Il western blotting proprio per il fatto di basarsi su questo rilevamento con gli ANTICORPI è estremamente SENSIBILE. Con 5 pg di PROTEINA si riesce ad avere un SEGNALE PULITO, con 30 pg si ha un SEGNALE PIU' FORTE ancora MOLTO PULITO. Se la QUANTITA' di PROTEINA AUMENTA MOLTO e la REAZIONE ENZIMATICA DI SVILUPPO NON viene BLOCCATA al MOMENTO OPPORTUNO si possono avere problemi di CROSS-REAZIONE. Un SEGNALE ACCETTABILE è dove si vede il SEGNALE PRIMARIO della PROTEINA DI INTERESSE e uno SCARSO SEGNALE di CROSS-REAZIONE che nel western c'è quasi sempre

Answer 71

La reazione con il LUMINOLO è una reazione di CHEMIOLUMINESCENZA molto utilizzata. La PEROSSIDASI è un ENZIMA che utilizza il PEROSSIDO DI IDROGENO come SUBSTRATO e questa reazione consente l'OSSIDAZIONE del LUMINOLO con conseguente EMISSIONE DI LUCE. La LUCE EMESSA può essere RILEVATA andando ad ESPORRE la MEMBRANA ad una LASTRA FOTOGRAFICA. E' una REAZIONE che deve avvenire in una CAMERA OSCURA al BUIO, si aggiunge alla NITROCELLULOSA la SOLUZIONE contenente il LUMINOLO e l'ACQUA OSSIGENATA. In seguito allo sviluppo di questa reazione c'è l'EMISSIONE DI LUCE che viene IMPRESSA su una LASTRA FOTOGRAFICA. Si SVILUPPA la LASTRA FOTOGRAFICA in CAMERA OSCURA e si vede una MACCHIA SCURA su una LASTRA CHIARA che corrisponde alla POSIZIONE della PROTEINA individuata sul GEL

Elettroforesi Flashcards

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