Dosaggio enzimatico Flashcards
(22 cards)
Enzimi
Sono dei CATALIZZATORI BIOLOGICI, ossia PROTEINE che ACCELERANO le REAZIONI METABOLICHE.
Gli enzimi hanno il ruolo di ABBASSARE l’ENERGIA DI ATTIVAZIONE dello STATO DI TRANSIZIONE.
Sono presenti nei FLUSSI BIOLOGICI, nel PLASMA in conseguenza del turnover cellulare. In genere la CONCENTRAZIONE degli enzimi nel plasma in condizioni fisiologiche è BASSA perché se aumentasse sarebbe indicazione di malfunzionamento di tessuti, organi o loro danneggiamento
Diagnostica clinica
Gli enzimi funzionano come INDICATORI DI FUNZIONALITA’ o LESIONE DI CELLULE o TESSUTI oppure possono funzionare da MARCATORI DI MALATTIE GENETICO-METABOLICHE che siano legate a SPECIFICI DEFICIT ENZIMI
Danneggiamento tessuti
Qualora ci siano LESIONI TISSUTALI per cui le CELLULE comincino a funzionare in MANIERA ANOMALA, la PERMEABILITA’ CELLULARE si MODIFICA e gli ENZIMI in CONCENTRAZIONE ELEVATA nel citoplasma passano nel PLASMA dove AUMENTA la loro CONCENTRAZIONE.
Un DANNEGGIAMENTO RAPIDO di POCHE CELLULE provoca un AUMENTO molto RAPIDO e RISTRETTO nel TEMPO della CONCENTRAZIONE di SPECIFICI ENZIMI che sono DIAGNOSTICI di particolari DANNI (es. epatite virale o infarto del miocardio).
Qualora il DANNEGGIAMENTO sia ESTESO e PROGRESSIVO, questo è molto LENTO e la CONCENTRAZIONE degli enzimi nel PLASMA NON AUMENTA in modo da essere DIAGNOSTICA del problema (es, cirrosi epatica)
Misura dell’attività enzimatica
Nel corso di una reazione enzimatica si assiste ad una DIMINUZIONE del SUBSTRATO dell’enzima e ad un progressivo AUMENTO del PRODOTTO di reazione.
Se si monitorasse nel TEMPO la DIMINUZIONE della CONCENTRAZIONE del SUBSTRATO o l’AUMENTO della CONCENTRAZIONE del PRODOTTO si può avere una MISURA dell’ATTIVITA’ ENZIMATICA
Metodi di misura dell’attività enzimatica
Il substrato e il prodotto devono essere otticamente rilevabili attraverso dei metodi spettrofotometrici.
Ci sono DUE METODI di misura dell’attività enzimatica
1. MISURA IN CONTINUO (SAGGIO CINETICO): si misura per ALCUNI MINUTI l’ANDAMENTO di una REAZIONE ENZIMATICA
2. A TEMPO FISSO (END POINT): la MISCELA di reazione viene fatta reagire per un TEMPO PRESTABILITO e al TERMINE dell’INCUBAZIONE si va a fare una LETTURA SPETTROFOTOMETRICA che consente di determinare la QUANTITA’ di PRODOTTO OTTENUTO o di SUBSTRATO CONSUMATO
Reazione enzimatica
Durante una reazione enzimatica la CONCENTRAZIONE del SUBSTRATO tende a DIMINUIRE man mano che si forma il prodotto e si ha una DIMINUZIONE della VELOCITA’ DI REAZIONE.
La determinazione della CONCENTRAZIONE dell’ENZIMA deve essere effettuata finché la formazione del PRODOTTO AUMENTA LINEARMENTE nel TEMPO ossia in condizioni di SUBSTRATO SATURANTE.
Bisogna mettere a disposizione dell’enzima una QUANTITA’ DI SUBSTRATO IN ECCESSO rispetto a quella che può utilizzare in modo tale che la VELOCITA’ sia MASSIMA all’INIZIO della reazione.
Così ci si trova in una condizione di LINEARITA’ dal momento che la formazione del PRODOTTO AUMENTA LINEARMENTE nel TEMPO.
Quando la concentrazione inizia a diminuire la velocità rallenta e la reazione perde la linearità.
Quando si fa un DOSAGGIO ENZIMATICO si considera la parte della REAZIONE in cui c’è LINEARITA’.
Per questo sono preferibili le MISURE IN CONTINUO che consentono di individuare DEVIAZIONI dalla LINEARITA’ in modo che si possa prendere in considerazione solo la parte lineare della reazione
Unità internazionale
La CONCENTRAZIONE degli ENZIMI viene calcolata in base all’ATTIVITA’ ENZIMATICA e i LIVELLI ENZIMATICI vengono riportati come UNITA’ ENZIMATICHE.
La CONCENTRAZIONE ENZIMATICA viene espressa come UNITA’ INTERNAZIONALI PER LITRO (U.I./l).
Una UNITA’ INTERNAZIONALE è la QUANTITA’ DI ENZIMA che catalizza la trasformazione di 1 MICROMOLE di SUBSTRATO in PRODOTTO in 1 MINUTO nelle condizioni di saggio ottimali per l’attività dell’enzima
U.I/l= ΔA/min x V x 1000/ ε mM x v
ΔA/min: variazione di assorbimento in un minuto (aumento [prodotti] e diminuzione [substrato] nel corso del saggio)
V: volume di reazione (ml)
1000: fattore di conversione a litri
ε mM: ε millimolare prodotto
v: volume del campione (ml)
Test ottico semplice
Viene applicato quando il PRODOTTO o il SUBSTRATO sono OTTICAMENTE RILEVABILI
Para nitrofenilfosfato (fosfatasi)
E’ un SUBSTRATO che viene usato nel saggio enzimatico.
Le FOSFATASI sono enzimi che IDROLIZZANO il FOSFATO.
Il SUBSTRATO fornito all’enzima è INCOLORE ma nel momento in cui la FOSFATASI IDROLIZZA il GRUPPO FOSFATO si forma il PARA NITROFENOLATO che ha un COLORE GIALLO e ha un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 405 nm.
Nel corso di un saggio enzimatico in cui si sta testando l’attività di una fosfatasi si può monitorare SPETTROFOTOMETRICAMENTE l’AUMENTO dell’ASSORBIMENTO a 405 nm dal momento che nel TEMPO AUMENTA la formazione di PARA NITROFENOLATO.
Da qui si calcola il ΔA/min, si divide per l’ε mM del para nitrofenolato, si effettuano gli altri calcoli e si ottengono le UNITA’ INTERNAZIONALI
Deidrogenasi
Un test ottico semplice si può applicare nel caso in cui si voglia dosare una DEIDROGENASI che sono ENZIMI che catalizzano delle REAZIONI DI DEIDROGENAZIONE.
Le DEIDROGENASI utilizzano dei COENZIMI che possono essere il NAD o il FAD.
Le deidrogenasi che utilizzano il NAD come coenzima possono produrre NAD+ o NADH a seconda della DIREZIONE in cui avviene la reazione.
Nel caso in cui si deve DOSARE l’ATTIVITA’ di un DEIDROGENASI si deve vedere la VARIAZIONE NEL TEMPO dell’ASSORBIMENTO dovuta alla presenza del COENZIMA
NAD (nicotinammide adenin nucleotide)
Forma ossidata NAD+
Forma ridotta NADH
La molecola è costituita da DUE DINUCLEOTIDI:
1. ADENINA, RIBOSIO e FOSFATO
2. FOSFATO, RIBOSIO e NICOTINAMMIDE
Per capire le forme di ionizzazione del NAD si utilizza l’ANELLO NICOTINAMMIDICO dal momento che nel NAD+ la NICOTINAMMIDE porta una CARICA POSITIVA sull’AZOTO.
Quando si forma il NADH entra uno IONE IDRURO sul CARBONIO per cui il DOPPIETTO ELETTRONICO si sposta sull’AZOTO che quindi ha il suo LONE PAIR DISPONIBILE (solo 3 legami) e si ha la forma RIDOTTA del COENZIMA.
Il NAD+ ha un MASSIMO DI ASSORBIMENTO a 260 nm in quanto i CROMOFORI del NAD+ sono l’ADENINA e l’ANELLO BENZENICO.
Il NADH ha anche un PICCO DI ASSORBIMENTO a 340 nm oltre a quello a 260 nm.
Il NADH differisce nella IONIZZAZIONE dell’ANELLO NICOTINAMMIDICO che è ridotto ed assorbe a 340 nm, me è sempre caratterizzato dall’adenina che assorbe a 260 nm.
Quindi quando si fa il dosaggio di una deidrogenasi si può seguire spettrofotometricamente l’AUMENTO dell’ASSORBIMENTO a 340 nm dovuto alla formazione del NADH o la DIMINUZIONE dell’ASSORBIMENTO a 340 nm dovuta alla formazione di NAD+
Test ottico accoppiato
Quando il PRODOTTO di reazione NON è RILEVABILE si va ad ACCOPPIARE alla reazione dell’ENZIMA DA DOSARE un’ALTRA REAZIONE di un altro enzima chiamata REAZIONE INDICATRICE che deve dar luogo ad un PRODOTTO OTTICAMENTE RILEVABILE.
E1 è l’ENZIMA da DOSARE.
L è il SUBSTRATO di questo ENZIMA.
L’ATTIVITA’ dell’ENZIMA NON deve essere LIMITATA dal SUBSTRATO L quindi si deve essere in condizioni di SUBSTRATO SATURANTE in modo che l’ENZIMA possa lavorare alla MASSIMA ATTIVITA’.
S è il PRODOTTO dell’ENZIMA E1 ma il SUBSTRATO dell’ENZIMA E2 cioè della reazione che viene accoppiata.
In questo caso l’ENZIMA E2 deve essere in ECCESSO in modo tale da NON LIMITARE la VELOCITA’ della REAZIONE INDICATRICE.
Tanto S si forma, tanto deve essere processato dall’enzima E2 e trasformato in PRODOTTO che risulterà essere OTTICAMENTE RILEVABILE.
E’ importante che entrambe le REAZIONI siano IRREVERSIBILI altrimenti non riuscirebbe a dosare correttamente l’enzima
Enzimi di interesse clinico
Le TRANSAMINASI AST/GOT (aspartato amminotrasferasi) e ALT/GPT (alanina amminotrasferasi).
Sono ENZIMI che sono indicatori della FUNZIONALITA’ EPATICA.
Un’ECCESSIVA CONCENTRAZIONE nel plasma può essere indice di un’ALTERATA FUNZIONALITA’ EPATICA.
L’AST è prognostica di INFARTO DEL MIOCARDIO.
Reazioni di transaminazione
Le transaminasi sono degli enzimi che TRASFERISCONO dei GRUPPI AMMINICI da un AA a un ALFA CHETOACIDO ACCETTORE.
Nel caso della AST e della ALT l’AA di riferimento è rispettivamente l’ASPARTATO e l’ALANINA.
L’ALFA CHETOACIDO ACCETTORE è l’ALFA CHETOGLUTARATO che ricevendo il GRUPPO AMMINICO dall’AA si trasforma in GLUTAMMATO e l’AA si trasforma nell’ALFA CHETOACIDO CORRISPONDENTE per cui
- dall’ALANINA si forma il PIRUVATO in una reazione catalizzata dall’ALANINA AMMINOTRASFERASI o GPT (glutammato piruvato transaminasi)
- dall’ASPARTATO si forma l’OSSALACETATO in una reazione catalizzata dall’ASPARTATO AMMINOTRASFERASI o GOT (glutammato ossalacetato transaminasi)
Malato deidrogenasi
L’OSSALACETATO e il GLUTAMMATO che sono i PRODOTTI DI REAZIONE della AST NON sono OTTICAMENTE RILEVABILI per cui bisogna associare una REAZIONE INDICATRICE ossia quella catalizzata dalla MALATO DEIDROGENASI.
In questo caso la reazione è OPPOSTA in quanto la MALATO DEIDROGENASI va a RIDURRE l’OSSALACETATO formando MALATO.
Si ha la formazione di NAD+ da NADH e il NAD+ è OTTICAMENTE RILEVABILE seguendo la DIMINUZIONE dell’ASSORBIMENTO a 340 nm dovuto al consumo di NADH
Lattato deidrogenasi (reazione indicatrice)
Nel caso dell’ALT anche PIRUVATO e GLUTAMMATO NON sono OTTICAMENTE RILEVABILI quindi si va ad accoppiare una REAZIONE INDICATRICE ossia quella della LATTATO DEIDROGENASI che catalizza la trasformazione del PIRUVATO in LATTATO con l’OSSIDAZIONE del NADH a NAD+.
Quindi si segue spettrofotometricamente la DIMINUZIONE dell’ASSORBIMENTO a 340 nm
Lattato deidrogenasi (sospetti di infarto del miocardio)
Viene dosata per la diagnosi di PATOLOGIE EPATICHE, CARDIACHE, MUSCOLARI, RENALI ed EMATOLOGICHE.
La lattato deidrogenasi è presente in 5 ISOFORME costituite da 4 SUBUNITA’ indicate con H (heart) e M (muscle) che si combinano diversamente:
- 4 H (muscolo cardiaco)
- 3 H e 1 M
- 2 H e 2 M
- 1 H e 3 M
- 4 M
Per poter distinguere le isoforme si fa una separazione elettroforetica.
Ci sono delle ISOFORME che AUMENTANO in particolari PATOLOGIE
- INFARTO DEL MIOCARDIO: AUMENTO LDH1 e LDH2 (isoforme con più subunità H)
- EPATITI ACUTE: AUMENTO LDH5 (costituita da 4 M)
In un SIERO NORMALE ci sono CONCENTRAZIONI BASSE di tutte le ISOFORME
Creatin chinasi (CK o CPK)
E’ un enzima che viene dosato in situazioni di possibile INFARTO DEL MIOCARDIO.
Questo enzima può essere particolarmente ALTERATO nel caso di PROBLEMI MUSCOLARI ma anche prognostico di DISTROFIA MUSCOLARE.
La creatin chinasi è l’enzima che nel MUSCOLO forma la FOSFOCREATINA ossia la prima RISORSA ENERGETICA a cui il MUSCOLO attinge quando si devono fare degli SFORZI CONCENTRATI nel TEMPO.
La FOSFOCREATINA si forma per FOSFORILAZIONE della CREATINA da parte della CREATIN CHINASI.
ELEVATI VALORI di creatin chinasi sono indice di DANNO MUSCOLARE (es. strappo) o INFARTO DEL MIOCARDIO, ATROFIA MUSCOLARE ed enormi quantitativi si riscontrano nella DISTROFIA MUSCOLARE.
Esiste in 3 ISOFORME costituite da 2 SUBUNITA’ definite B (brain) e M (muscle)
- MM: predominante in individui che non hanno problemi
- MB: prognostica di infarto acuto del miocardio
- BB
Reazioni indicatrici CK
La creatin chinasi catalizza la reazione che porta alla formazione di creatina e ATP da fosfocreatina e ADP.
Visto che ATP e CREATINA NON sono spettrofotometricamente MISURABILI, a questa reazione ne vengono ACCOPPIATE DUE per avere un PRODOTTO di reazione OTTICAMENTE RILEVABILE.
La prima reazione che viene accoppiata è quella dell’ESOCHINASI che catalizza la formazione del GLUCOSIO 6P da glucosio e ATP.
Il GLUCOSIO 6 P viene utilizzato come substrato della GLUCOSIO 6 P DEIDROGENASI che utilizza come coenzima il NADP+ che viene trasformato in NADPH + H+ e il GLUCOSIO 6 P viene trasformato in FOSFOGLUCONATO.
Il NADPH ha le STESSE CARATTERISTICHE SPETTROFOTOMETRICHE del NADH per cui si va a leggere l’AUMENTO dell’ASSORBIMENTO a 340 nm
Grafico: come varia l’effetto degli enzimi nell’infarto del miocardio
Concentrazione degli enzimi in funzione del tempo
Nell’arco delle prime 24 ore si ha un notevole aumento dell’isoforma MB della creatin chinasi e un discreto aumento dell’AST.
La lattato deidrogenasi aumenta più lentamente nel tempo ma la sua concentrazione rimane alta anche per molti giorni.
E’ importante dosare enzimi che hanno andamenti diversi per fare una diagnosi accurata perché dopo giorni i livelli di AST e CK si abbassano e potrebbero non far pensare ad un infarto del miocardio mentre quelli della LDH rimangono alti per parecchi giorni
γ Glutammil transpeptidasi (γGT o GGT)
E’ un enzima comunemente dosato nelle analisi del sangue.
E’ un enzima la cui attività è quella di TRASFERIRE dei GRUPPI γ GLUTAMMILICI tra PEPTIDI e SINGOLI AA.
Il GLUTATIONE contiene il gruppo γ GLUTAMMILICO e è un TRIPEPTIDE costituito da GLICINA, CISTEINA e ACIDO GLUTAMMICO.
L’ACIDO GLUTAMMICO è legato alla CISTEINA tramite il GRUPPO COOH in γ.
Il γGT è un enzima fondamentale del METABOLISMO e svolge un ruolo importante nel RECUPERO del GLUTATIONE EXTRACELLULARE che viene IDROLIZZATO e il GRUPPO GLUTAMMILICO viene trasferito a un altro AA che ne consente il TRASFERIMENTO nella CELLULA.
Il γGT è un enzima che AUMENTA nel caso di ABUSO CRONICO di ALCOL o OSTRUZIONE dei DOTTI BILIARI. Consente di valutare la FUNZIONALITA’ EPATICA e RENALE.
I LIVELLI di γGT ritornano NORMALI dopo 2-3 SETTIMANE dall’ASTENSIONE all’uso di ETANOLO.
Se l’individuo non ha patologie importanti al fegato, il livello di γGT tende a ritornare normale.
Nel DOSAGGIO di questo enzima la REAZIONE è DIRETTA quindi viene applicato un TEST OTTICO SEMPLICE. Viene fornito all’enzima un SUBSTRATO che ha un GRUPPO γ GLUTAMMILICO in modo tale che questo enzima possa TRASFERIRE il GRUPPO γ GLUTAMMILICO ad un ACCETTORE (glicina) e il PRODOTTO ha un ASSORBIMENTO che può essere misurato a 405 nm. Si assiste quindi ad un AUMENTO dell’ASSORBIMENTO a questa lunghezza d’onda
Glucosio 6 fosfato deidrogenasi
Una CARENZA di glucosio 6 fosfato deidrogenasi è legata ad una malattia conosciuta come FAVISMO.
La GLUCOSIO 6 P DEIDROGENASI catalizza la trasformazione del GLUCOSIO 6 P in 6 FOSFOGLUCONOLATTONE nello shunt dei pentosi. In questa reazione viene prodotto NADPH (equivalente riduce importante nella protezione delle cellule dallo stress ossidativo).
Nei globuli rossi lo shunt dell’esoso monofosfato è la principale sorgente di equivalenti riducenti che possono essere utilizzati per la riduzione del glutatione ossidato a glutatione ridotto.
La possibilità di avere a disposizione negli eritrociti degli equivalenti riducente che consentono di formare degli scavengers, delle specie reattive dell’ossigeno è fondamentale per mantenere l’integrità di queste cellule.
La CARENZA di G 6P DEIDROGENASI comporta una DIMINUITA RESISTENZA ERITROCITARIA agli STRESS OSSIDATIVI e questo determina una EMOLISI PREMATURA causata da danni ossidativi. Questa carenza è nota come FAVISMO in cui si ha l’IMPOSSIBILITA’ di riportare il GLUTATIONE in FORMA RIDOTTA.
Per gli ERITROCITI diventi estremamente DIFFICILE la DETOSSIFICAZIONE dei ROS e di tutti quei RADICALI che possono DERIVARE da FARMACI usati per la cura delle INFEZIONI (solfamidici o antimalarici) o da AGENTI TOSSICI contenuti nelle FAVE ma anche PISELLI, POLLINI.
E’ una malattia rara legata al cromosoma X.
La CRISI EMOLITICA può durare 2-3 GIORNI fino a 1 SETTIMANA con ONDATE FEBBRILI e la ROTTURA dei GLOBULI ROSSI dal 30 al 50%. Una GRAVE CRISI EMOLITICA potrebbe portare anche alla MORTE.
Ci sono vari LIVELLI DI GRAVITA’ della malattia in quanto si ha CARENZA ma non la totale mancanza dell’enzima.
Il DOSAGGIO di questo enzima è facile perché essendo una deidrogenasi utilizza il NADPH come coenzima di cui si può osservare l’AUMENTO dell’ASSORBIMENTO a 340 nm
