11.pred

Question 1

transformirajuća DNA za transformaciju kvasca može biti:

Answer 1

replikativna
nereplikativna (integrativna)

Question 2

što sve možemo raditi sa transformirajućom DNA

Answer 2

popravak dvolančanog loma homolognom rekombinacijom
ends-in
ends-out
ciljanje gena (gene-targeting)
zamjena gena (gene-replacement)

Question 3

zamjena gena

Answer 3

ends-in, gene replacment
model za gensku terapiju
oni homologni krajevi na transformirajućoj DNA ne moraju biti homologni samo sa okolinom jednog gena već mogu omeđivati 10, 15 ili 100 gena

Question 4

gensko ciljanje

Answer 4

ends-in, gene-targeting

Question 5

kako se kod kvasca popravlja dvolančani lom?

Answer 5

homolognom rekombinacijom

Question 6

kako se dvolančani lom popravlja kod drugih eukariota npr. ljudi?

Answer 6

ilegitimnom integracijom odnosno nehomolognim spajanjem krajeva

Question 7

mehanizam pop-out rekombinacije

Answer 7

pravi pop-out
SSA (single-strand annealing)

Question 8

ilegitimna rekombinacij

Answer 8

integracija plazmida na neko nasumično mjesto u genomu kvasca, ne u homolognu regiju
1000x rjeđe od homologne rekombinacije

Question 9

jednostruka i višestruka integracija

Answer 9

ponovi u skripti

Question 10

primjena integrativnih plazmida

Answer 10

-precizna modifikacija kvaščevog genoma (nekog gena ili bilo koje sekvencije)
-inaktivacija, razaranje gena - gene disruption
-zamjena gena (gene replacment) sa linearnim fragmentima, rekombinacija ends out

Question 11

primjena replikativnih plazmida

Answer 11

kloniranje točno određenog gena ili sekvencije

Question 12

razaranje gena kakav je plazmid?

Answer 12

konstruiramo plazmid na kojem se nalazi središnji dio gena
linearizacijom tog plazmida usmjeravamo integraciju tog plazmida upravo u taj gen

Question 13

razaranje gena- nedostatak metode

Answer 13

nedostatak ove moetode je to da uastopne regije koje su nefunkcionalne mogu rekombinirati i dati funkcionalan gen

Question 14

zašto koristimo replikativne plazmide?

Answer 14

koristimo ih ako nas zanima koja sekvenca, mutacija se možda nalazi u nekom mjestu u genomu
replikativni plazmid mora sadržavati sekvencu koja nas zanima u genomu kvasca
uvedemo dvolančani jaz restrikcijskim enzimima u onaj dio plazmida koji sadrži sekvencu koja nas zanima

Question 15

mutageneza in vitro što je to i koja je svrha?

Answer 15

uvođenje mutacija u kloniranu DNA
svrha je analiza gena i proteina, proteinski i metabolički inženjering
uvodimo in vitro točno određenu mutaciju

Question 16

koje vrste mutageneza imamo

Answer 16

1.nasumična:
-oštećivanje DNA kemijskim i fizičkim sredstvima (UV, hidrazin, nitritna kiselina)
-PCR-smanjujemo preciznost Taq polimeraze pa uvodi više grešaka tijekom sinteze DNA
2.ciljana mutageneza in vitro:
-korištenjem restikcijskih i modifikacijskih enzima
-PCR
-ciljana mutageneza po Kunkelu

Question 17

uvođenje ciljane mutacije restrikcijskim enzimom nedostatak

Answer 17

ograničeni smo sa restrikcijskim enzimo, mi želimo pristup da napravimo bilo kakvu promjenu

Question 18

prednosti i mane kod ciljane mutageneze PCRom

Answer 18

prednost: brza metoda
mane: skuplje zbog 4 primera, PCR je sam po sebi mutagen, lošija metoda od one po Kunkelu

Question 19

analiza transformanata nakon mutageneze po Kunkelu

Answer 19

-restrikcijskom analizom-mutacija je stvorila ili razorila neko restrikcijsko mjesto
-analiza hibridizacijom- kako bi provjerili je li mutacija fiksirana