vježbe

Question 1

koji vektor smo koristili

Answer 1

pBluescript II (pBRII)

Question 2

šta smo radili na vježbama, tj. koji je cilj vježbi?

Answer 2

konstrukcija knjižnice gena bakteriofaga lambda

Question 3

kako možemo konstruirati plazmide u laboratoriju?

Answer 3

metodama genetičkog inženjerstva, tj. tehnologijom rekombinantne DNA

Question 4

karakteristike pBRII

Answer 4

-oko 3kb
-fagmidni vektor pa se zbog toga može izolirati i u jednolančanom obliku jer sadrži intergensku regiju iz genoma filamentoznih faga (duljina 454 pb)- f1-ori
-gen bla
-fragment gena lacZ koji kodira za N.terminalni dio beta-galaktozidaze
-MCS koji je insertiran iza kodona za 36. AK gena lacZ koji omogućuje plavo-bijelu selekciju

Question 5

veličina genoma bakteriofaga lambda

Answer 5

48,5 kb
na krajevima ima cos sekvencije koje omogućavaju cirkularizaciju genoma faga prije mjesno-specifične integracije u genom domaćina

Question 6

kako možemo inaktivirati restrikcijske enzime?

Answer 6

-toplinom- 15 do 20 minuta pri 70 stupnjeva
-dodatkom EDTA do koncentracije veće od 5mM
-uklanjanjem enzima iz restrikcijske otopine ekstrakcijom pomoću fenola

Question 7

koju sekvencu prepoznaje EcoRV i kako cijepa

Answer 7

GATATC, ostavlja ravne krajeve

Question 8

koju elektroforezu smo radili na vježbama

Answer 8

horizontalna agarozna gel-elektroforeza pri naponu od 1-5

Question 9

koje boje u migracijskom bojilu

Answer 9

ksilen cijanol FF (plava)- oko 5000 pb
brom-fenol plavo (ljubičasto)- 500 pb

Question 10

šta moramo napraviti nakon provjere uspješnosti cijepanja DNA bakteriofaga lambda

Answer 10

nacrtati baždarni dijagram na temelju rezultata elektroforeze DNA bakteriofaga lambda pocijepane restrikcijskom endonukleazom HindIII

Question 11

taloženje DNA

Answer 11

amonijevim acetatom i etanolom
DNA se taloži minimalno dva sata na -20 i nakon toga centifugiramo 20 minuta na 14 000 okretaja pri 4 stupnjeva

Question 12

defosforilacija koji enzim koristimo

Answer 12

alkalna fosfataza

Question 13

što nakon defosforilacije

Answer 13

uklanjamo fosfatazu jer produljena inkubacija s alkalnom fosfatazom može uzrokovati hidrolizu nukleotida s 5’-kraja, a aktivnost fosfataze u ligacijskoj smjesi rezultirat će defosforilacijom 5’-krajeva inserata. njena prisutnost na krajevima DNA može ometati djelovanje DNA ligaze i utjecati na migraciju DNA tijekom elektroforeze

Question 14

defosforilacija protokol

Answer 14

u reakcijsku otopinu ide:
-plazmidna DNA
-pufer 10x koncentrirani
-alkalna fosfataza
-sterilna deionizirana voda
inkubira se 30 minuta u vodenoj kupelji pri 37 stupnjeva

Question 15

kako se zaustavlja reakcija defosforilacije

Answer 15

dodatkom EDTA 5mM, nakon dodatka se reakcijska smjesa zagrijava na 75 stupnjeva 15 minuta

Question 16

što dodajemo da povećamo uspješnost pri ligaciji ravnih krajeva

Answer 16

PEG4000 i više jedinica T4 DNA ligaze

Question 17

pri kojoj temperaturi se provodi reakcija ligacije

Answer 17

16-22 stupnjeva

Question 18

kako se inaktivira reakcija ligacije

Answer 18

zagrijavanjem na 65 stupnjeva
inače se inaktivira prije provođenja ef jer kada je vezana na DNA utječe na migraciju fragmenata DNA

Question 19

sastav ligacijske otopine

Answer 19

-plazmidna DNA pocijepana sa EcoRV
-DNA faga lambda pocijepana sa EcoRV
-10x koncentriran pufer
-T4 DNA ligaza
-sterilna deionizirana voda
inkubira se preko noći na 20 stupnjeva

Question 20

kako se provjerava uspješnost ligacije

Answer 20

elektroforezom u agaroznom gelu

Question 21

kompetentne stanice

Answer 21

stanice koje imaju sposobnost prihvatiti molekule DNA iz okoline
e.coli nije prirodno kompetentna tako da postaje laboratoriskim postupkom pripreme kompetentnih stanica

Question 22

priprema kompetentnih stanica

Answer 22

vježbe 14.str

Question 23

kako se izražava uspješnost transformacije

Answer 23

broj transformiranih stanica u cjelokupnom volumenu smjese za transformaciju po mikrogramu plazmidne DNA

Question 24

kada ipak neće doći do inaktivacije iako se insertirao insert?

Answer 24

-ako je insert relativno mali i ako ne pomiće okvir čitanja, također i ako unutar okvira čitanja nema STOP kodon

Question 25

kako možemo provjeriti je li fosfataza dobro odradila defosforilaciju?

Answer 25

-kao kontrolu u jednu jažicu stavimo pocijepani plazmid -u drugu jažicu stavimo plazmid koji je pocijepan i tretiran sa fosfatazom -ako kao rezultat dobijemo istu vrpcu kao kontrola onda znamo da je fosfataza odradila svoj posao -ako dobijemo rezultat vrpcu koja je mali iznad kontrole onda znači da se vektor religirao i da fosfataza nije odradila svoj posao, jer otvoreni krug putuje malo sporije od linearne DNA

Question 26

koliko je stanica u jednoj koloniji

Answer 26

10 na 10

Question 27

kod ef koliki je volumen uzorka i boje

Answer 27

5 mikrolitara uzorka i 1 mikrolitar boje = 6 mikrolitara

Question 28

uloge migracijskog bojila

Answer 28

1.migracija boja i procjena gdje se DNA nalazi 2.obojenost uzorka olakšava stavljanje u jažicu 3.glicerol ili saharoza koja je unutra također olakšava stavljanje u jažice jer uzorak padne na dno jažice

Question 29

restrikcijska analiza odabranih klonova

Answer 29

1.kružnu plazmidnu DNA koju smo izolirali iz odabranih transformanata pocijepamo sa EcoRV i provedemo ef, markeri su nepocijepani pBSII, pBSII pocijepan sa EcoRV i genom faga pocijepan sa EcoRV 2.uspoređujemo rezultate ef markera i pocijepanih plazmida i možemo utvrditi koje fragmente iz genoma vektor sadrži

Question 30

karakteristike početnica

Answer 30

Tm (melting temperatura) primera mora biti otprilike ista dobijemo primere pomoću programa primeri moraju biti takvi da ne nastaju sekundarne strukture unutar samih primera (petlje)

Question 31

kada je restrikcijska mapa potpuna

Answer 31

ako imamo ime plazmida, veličinu plazmida, restrikcijska mjesta i položaj restrikcijskih mjesta

Question 32

reakcijska otopina za PCR

Answer 32

početnice, DNA kalup, pufer, DNA- pol koja je termorezistentna, dNTPovi

Question 33

parcijalna digestija

Answer 33

kada se cijepanje ne provodi do kraja pa dobijemo veće fragmente od najvećeg očekivanog

Question 34

pufer za pripremu agaroznog gela

Answer 34

TBE pufer- tris boratni edta pufer