3.pred Flashcards
agarozni nosači
pročišćeni prirodni polisaharid izgrađen od D-galaktoze i 3,6-anhidro-L-galaktoze povezane alfa-1,3 i beta-1,4glikozidnom vezom
izolira se iz morskih algi
pročišćavanjem se uklanjaju drugi šećeri, proteini, soli
prosječna duljina lanca-oko 800 monomera galaktoze
low melting point agaroza
kemijski modificirana
talište joj je sniženo na 65 stupnjeva
ona se lakše otapa, gel se priprema na nižoj temperaturi, a i kada imamo gotov gel onda ga možemo otopiti na nižoj temperaturi, tj. ne moramo ga zagrijavati do vrenja
koncentracija agaroze u gelu, veličina fragmenata koje razdvaja i promjer pora
0,5 do 2 %
100 pb do 25 000pb
oko 150 nm u 1% agarozi
poliakrilamidni gel koncentracija, veličine fragmenata
3,5 do 20 %
razdvajanje molekula kraćih od 2000 nukleotida
koristi se za sekvencioniranje kada se provodi u denaturirajućim uvjetima
na migraciju dvolančanih molekula nukleinskih kiselina utječe i primarna struktura (redoslijed nukleotida)
brzina migracije ovisi o:
veličini molekule, konformaciji, koncentraciji nosača, puferu i naponu
migracijsko bojilo
specifično teže od vode
glicerol, fikol, saharoza
etidij bromid
inkubiramo nakon ef 15-20 min
interkalira DNA, apsorbira UV svjetlo i emitira svjetlo valne duljine od 590 nm (narančasto-crveni odsjaj)
mutagen
možemo ga dodati u gel ili pufer prije elektroforeze
standard
smjesa fragmenata poznatih veličina koji su različite veličine
kod superzavijenosti formula
L=T+W
L-vezni broj
T-stupanj zavijenosti
W-stupanj superzavijenosti
u relaksiranom stanju sve je 0
provjera uspješnosti izolacije plazmida
elektroforeza kružnog nativnog plazmida
provjera uspješnosti restrikcije
elektroforeza lineariziranih plazmida
provjera uspješnosti kloniranja
imamo standard, u jednoj jažici samo insert, u drugoj jažici konstruirani plazmid (vektor s insertom) pocijepan odgovarajućim restrikcijskim enzimom
formula za brzinu migriranja
v=K*1/logL
K-konstanta
L-duljina fragmenata DNA u pb
vrijedi samo za linearne dvolančane molekule
krivulja ovisnosti log pb o duljini puta koji je fragment prošao
linearna u samo jednom dijelu, izgled krivulje ovisi o gustoći gela, krivulja izgleda tako jeršto je fragment veći prolazi manji put jer sporije putuje
u linearnom dijelu je razdvajanje poželjno
određivanje mase (koncentracije) DNA
na temelju usporedbe intenziteta vrpce s intenzitetom vrpce u kojoj se nalazi poznata masa DNA (standard)
elektroforeza u pulsirajućem električnom polju - veličine fragmenta
20 kb- 5 Mb
izvedbe pulsirajuće gel ef
FIGE
TAFE
RGE
CHEF
preparativna elektroforeza
pomoću DEAE-membrane (dietil aminoetil)
elektorleucija
ekstrakcija DNA iz agaroznog gela niskog tališta
adsorpcija na staklene kuglice
