gi Flashcards
metode jednolikog obilježavanja molekula nukleinskih kiselina
pomak zareza, nasumično započivanje, PCR, transkripcija in vitro
detekcija neradioaktivne probe
neposredno (fluorescentne probe), posredno
metode pretraživanja genomske banke
komplementacija mutacije, umnažanje željene DNA PCR-om, imunološka detekcija, hibridizacijske metode
metode obilježavanja nukleinskih kiselina
radioaktivno (obilježavanje krajeva i jednoliko obilježavanje nukleinskih kiselina)
obilježavanje krajeva nukleinskih kiselina
3’-kraj je uvučen (koristimo polimerazu KLenow fragment), Taq polimeraza, polinukleotid fosfataza/kinaza, terminalna deoksiribonukleotidil transferaza
analiza mRNA primjena
razina ekspresije gena, određivanje broja egzona
metode za analizu polimorfizma
RFLP, VNTR, fAFLP, RAPD, SSCP, FISH, DNA-mikropolja, DGGE (TGGE), Analiza heterodupleksa, Sekvencioniranje DNA
sekvence pogodne za genetičku analizu
cjelokupni genom, mitohondrijska DNA, ponovljene sekvencije, specifični geni, rDNA
rDNA
najčešća sekvencija za genotipizaciju, sadrži jako sačuvane (konzervirane) i varijabilne regije, nalazi se u genomima svih organizma, kod prokariota imamo jednu ili više kopija (sedam u e.coli), kod eukariota više stotina uzastopno direktno ponovljenih kopija
sekvencioniranje DNA
zasniva se na mogućnosti razdvajanja obilježenih polinukleotidnih lanaca čija se duljina razlikuje u jednom nukleotidu
postupak sekvencioniranja DNA
priprema DNA prije ef, dvije metode (kemijska i sangerova), vizualizacija DNA
ef za sekvencioniranje
razdvajanje polinukleotidnih lanaca čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid, poliakrilamidna, denaturirajući uvjeti
strategije sekvencioniranja cjelokupnog genoma
shotgun sekvencioniranje i hijararhijsko sekvencioniranje
metode sekvencioniranja DNA
sekvencioniranje nove generacije, kemijska metoda i Sangerova metoda
broj gena u kvascu
5800
što nakon sekvencioniranja?
genomska istraživanja(bioinformatika i eksperimentalni genomski pristupi) i ne-genomski eskperimenti
transformirajuća DNA za transformaciju kvasca može biti
replikativna i nereplikativna(integrativna)
replikativni vektori
YEp, YRp, YCp, YAC
integrativni vektori
1.YIp- plazmidi koji ne sadrže ishodište replikacije u kvascu, za transformaciju mogu se koristiti u kružnom i lineariziranom obliku i 2.linearni fragmenti
primjena integrativnih i replikativnih plazmida
precizna modifikacija kvaščevog genoma, kloniranje točno određenog gena ili neke sekvence, inaktivacija, razaranje gena (gene disruption), zamjena gena (primjena fragmenata DNA za rekombinaciju ends-out)
svrha mutageneze in vitro
analiza uloge gena i proteina, proteinski i metabolički inženjering
tehnike unošenja DNA u biljnje i životinjske stanice
protoplastiranje i fuzija protoplasta, injektiranje direktno u jezgru, virusi (retrovirusi)-transdukcija, liposomi-DNA okružena lipofilnim slojem, elektroporacija-kratki puls visokog napona, biolistička transformacija-bombardiranje česticama na kojima se nalazi DNA (gene gun), Agrobacterium tumefaciens-Ti plazmid, gentičke modifikacije biljaka, konjugacija između različitih vrsti
podloga HAT
sadrži hipoksantin, aminopterin, timidin