8.pred Flashcards
primjena Souther blota
-pretraživanje banke gena
-molekularna analiza klonova (na nivou DNA)
-analiza transformanata i konstruiranih sojeva
što Southern blot omogućava
nakon što izoliramo DNA mi možemo, ali i ne moramo provesti restrikciju, provedemo ef i vizualiziramo gel i ako provedemo Southern blot on nam omogućava vizualizaciju samo onih fragmenata koji su komplementarni s probom
pod koju metodu spada Souther blot?
RFLP
bez restrikcije pa southern primjer
ono kod kvasca koji ima deletiran gen arg4
restrikcija pa souther primjer
ono kod bakterije di nakon ef vidimo smear
southern blot postupak u 4 koraka
1.gel elektroforeza pocijepane ili nepocijepane DNA
2.transfer DNA iz gela na membranu (najlonska, pozitivno nabijena)
3.hibridizacija s probom (radioaktivno ili neradioaktivno obilježena)
4.detekcija komplementarno sparene probe (na membrani)
transfer kod souther blotta
-prvo gel nakon elektroforeze inkubiramo u otopini etidij bromida kako bi vizualizirali vrpce i slikamo u UV-transiluminatoru
-nakon toga gel inkubiramo 10 minuta u 0,25 M otopini HCla da bi došlo do depurinacije, tj. kako bi fragmentirali DNA zbog lakšeg transfera
-nakon toga gel isperemo vodom i inkubiramo 10 min u otopini 1M NH4Ac/ 0,4 M NaOH kako bi denaturirali DNA
-sada možemo profesti tranfer u denaturirajućim uvjetima
vrste transfera kod southern blotta
kapilarni
elektro
vakuum
kapilarni transfer
traje 12-24 sata
elektro transfer
u pufer stavimo takozvani sendvič tako da imamo gel, određene nosače i onda membranu
pustimo struju tako da se DNA iz gela preslika na membranu
vakkum transfer
imamo kadicu i na dnu je porozni filter sa puno rupica koje dozvoljavaju protok tekućine, na poroznu ploču se stavi membrana i onda preko toga gumena maska, preko maske stavimo gel i onda pufer, ima i vakuum pupa
dolje nastaje podtlak i zbog toga pufer od gore prelazi dolje i vuče DNA kroz gel i DNA ostaje na pozitivnoj membrani
postuoak hibridizacije kod southerna
-nakon transfera potrebno je membrabu inkubirati 15ak min u 1M otopini amonijeva acetata i zagrijavamo na 120 stupnjeva kako bii trajno vezali DNA za membranu
-nakon toga inkubiramo membranu u predhibridizacijsku otopinu (sadrži SDS, soli, puno nespecifične DNA) -blokiranje membrane kako bi spriječili nespecifično vezanje probe na membranu, događa se u zataljenoj vrećici u kupelji uz potresanje
-potrebno je denaturirati probu zagrijavanje 10 min na 95 stupnjeva te naglo ohladiti u ledu
-sondu dodajemo u predhibridizacijsku otopinu i inkubiramo 16-20 sati pri 68 stupnjeva uz potresanje
-ako proba nije dovoljno homologna željenoj sekvenci hibridizacija se provodi pri nižoj temperaturi
priprema probe označene digoksigeninom kod southern blotta
prilikom sinteze označava se DNA cijelom duljinom pomoću DNA polimeraze i dodaju se svi dNTPovi i DIG-11-dUTP (digoksigenin-11-deoksiuridin-5’-trifosfat), ugrađuje se nasuprot adenina
detekcija kod southern blotta
-nakon provedene hibridizacije potrebno je membranu višekratno isprati i pri sobnoj temperaturi i pri 68 stupnjeva kako bi uklonili nespecifično vezanu probu ako je uopće ima
-nakon toga je potrebno membranu zasititi proteinima kako bi sprječili nespecifično vezanje antitijela na membranu (1 sat pri sobnoj temperaturi uz potresanje)
-nakon toga je vezanje antitijela 30 min pri sobnoj temperaturi uz potresanje
-antitijelo ima na sebi enzim alkalna fosfataza i ako dodamo supstrat X-fosfat i NBT kao induktor koji daje ljubičasto obojenje
-inkubiramo u mraku pri 37 stupnjeva do pojave vrpci
-zaustavljamo reakciju ispiranjem membrane u TE-puferu ili vodi
-osušimo i skeniramo ili fotografiramo
zašto analiziramoo mRNA
kako bi odredili razinu eskpresije gena i identificirali egzone
metode analize mRNA
northern blotting
RT-PCR
S1 mapiranje
northern blotting
analiziramo mRNA
postupak:
izoliramo mRNA (pomoću kolone)
provedemo ef u denaturirajućim uvjetima pa razdvajamo RNA po velićini
transfer na membranu
hibridizacija sa sondom koje je najčešće DNA jer je stabilnija
detekcija
problem su RNaze koje su jako otporni enzimi a ima ih na koži
RT-PCRT, S1 mapiranje
skripta
