9.pred

Question 1

metode za anlizu polimorfizma

Answer 1

RFLP, VNTR, fAFLP, RAPD, SSCP, sekvencioniranje, DNA čipovi, FISH, DGGE, analiza heterodupleksa

Question 2

rDNA broj kopija kod eukariota i prokariota

Answer 2

nalazi se u genomima svih organizama
prokarioti-jedna ili više kopija (sedam kod e.coli)
eukarioti- više stotina uzastopno ponovljenih kopija

Question 3

robosomi broj kod e.coli i eukariotska stanica

Answer 3

e.coli 20 000
eukariotska 10 na 6

Question 4

broj transkripta kod prokariota i eukariota

Answer 4

prokarioti-jedan transkript
eukarioti-dva transkripta; RNA-polimeraza I i RNA-polimeraza III
transkrpti se procesiraju

Question 5

rDNA

Answer 5

sadrži varijabilne (ETR i ITS) i konzervirane regije
analizom varijabilnih regija možemo razlikovati filogenetski bliže organizme
analizom konzerviranih regija možemo razlikovati filogenetski udaljenije organizme

Question 6

ponovljene sekvence-podjela i zašto ih analiziramo

Answer 6

podjela:
-razbacane ili disperzne sekvence
-uzastopno ponovljene sekvence: direktna ponavljanja, obrnuta ponavljanja, sa ili bez spacera - odjeljujuća sekvencija

analiziramo lokus kod dva organizma i zaključimo da nemaju isti broj ponavljanja ili možda drukčiju orijentaciju ili neku mutaciju pa znamo da su različiti

Question 7

koje mutacije možemo detektirati pomoću rflpa

Answer 7

točkaste mutacije (insercija, delecija, supstitucija)
velike insercije i delecije
inverzija i translokacija

zbog mutacija može doći do nastanka ili gubitka restrikcijskog mjesta, tako da se ovom metodom detektiraju mutacije u restrikcijskom mjestu

Question 8

rflp-puni naziv i ukratko postupak

Answer 8

polimorfizam veličine restrikcijskih fragmenata

1.priprema DNA - izolacija ili umnažanje PCRom
2.restrikcija i ef. ovisno o veličini fragmenata odaberemo nosač
3.hibridizacija sa sondom koja može biti specifični gen, sekvenca ili rDNA (ribotyping)

Question 9

RAPD-puni naziv, zašto koristimo

Answer 9

analiza slučajnim umnažanjem polimorfne DNA

koristimo za uspoređivanje sojeva, uzoraka
brza, jeftina metoda, problem je interlaboratorijska reproducibilnost

Question 10

VNTR-puni naziv i zašto se koristi, navedi primjer sa slajda

Answer 10

polimorfizam broja uzastopno ponovljenih fragmenata

koristi se da vidimo razliku između dvije jedinke iste vrste jer analiziramo lokuse koji sadrže ponovljene skevence koju su nestabilne, tj. lako se mijenjaju

primjer lokusa D1S, čovjek ima dva ovakva lokusa

Question 11

primeri za VNTR

Answer 11

4 primera
32-TAG-A
32-TAG-T
TAG
32D

Question 12

VNTR postupak

Answer 12

1.sinteza DNA u dvije otopine (obje epice sadrže DNA kalup, DNA polimerazu, pufer za polimerazu, dNTPovi, u prvu epicu ide primer za A, a u drugu primer za T), KALUP DENATURIRAMO
2.dodamo početnicu koja se komplementarno spaja sa D1S8
3.dodamo početnicu koja je komplementarna lokusu D1S8 i početnicu TAG-NAPRAVIMO PCR
4. ef i kao standard koristimo DNA koja je takva da određeni band odgovara broju ponavljanja

Question 13

jel moguće kod VNTRa da se primer za T komplementarno spoji sa A sekvencom

Answer 13

da on se zapravo komplementarno spari na puno mjestqa jer su A i T sekvence praktički iste, samo se razlikuju u jednom nukleotidu na 3’-kraju, to nam ipak ne stvara problem jer ako koristimo DNA-polimerazu koja nema 3’-5’-lektorirajuću aktivnost onda neće doći do sinteze pošto taj nukleotid na 3’-kraju neće se komplementarno spariti

Question 14

zašto dolazi do pojava genetičkih bolesti kada su roditelji u srodstvu?

Answer 14

jer je veća mogućnost do isplovljavanja recesivnih alela

Question 15

fAFLP-puni naziv, zašto koristimo

Answer 15

polimorfizam duljine umnoženih fluorescentnih fragmenata

enzimi su EcoRI i MseI
koristimo za usporedbu odnosno identifikaciju nekih nepoznatih izolata, bakterija ili kvasaca
postoji software koji međusobno uspoređuje signale i kaže koji je postotak sličnosti

Question 16

fAFLP postupak

Answer 16

1.izoliramo DNA
2.cjelokupna DNA sa pocijepa sa dva restrikcijska enzima EcoRI (6pb) i MseI (4pb)- ostavljaju 5’-ljepljive krajeve
3.dodajemo adaptore, adaptor i za sekvencu koja je nastala cijepanjem sa E i za onu koja je nastala cijepanjem sa M
-adaptor ima istureni kraj koji se komplementarno spari sa isturenim krajem koji je nastao kao posljedica cijepanja restrikcijskim enzimom
4.PCR sa preselektivnom početnicom, ona je u potpunosti komplementarna sa adaptorom samo još sadrži jedan nukleotid na 3’-kraju jer se on spaja sa ostatkom restrikcijskog mjesta
5.PCR sa selektivnim početnicama nakon što smo umnožili 1/16 fragmenata
6.ef u denaturirajućim uvjetima, poliakrilamidni gel
7.detekcija autoradiografijom ili fluorescencijom (kapilarna ef)

Question 17

koja je vjerojatnost da će preselektivni primer služiti kao primer za sintezu DNA u PCRu? kod AFLPa

Answer 17

u pravilu 25% ako je jednak udio GC/AT pb, ako je taj primer komplementaran sa tim jednu dodatnim nukleotidom s ostatkom fragmenta koji umnažamo

Question 18

zašto se samo umnažaju M-E fragmenti kod AFLPa?

Answer 18

zato što prije dodavanja početnica trebamo denaturirati fragment sa adaptorima kao što se inače radi kod PCRa i ako imamo fragmente M-M i E-E koji imaju iste adaptore na krajevima doći će do intralančanog sparivanja i preselektivne početnice se neće moći spojiti
na temelju sličnosti odnosno razlika možemo raditi filogenetsku analizu

Question 19

što su to selektivne početnice kod AFLPa?

Answer 19

na njih dodajemo još dva nukleotida na 3’-kraju, vjerojatno su to dva ista nukleotida jer je vjerojatnost umnažanja sada 1/16*1/16
ovaj primer je obilježen

Question 20

koliko ćemo fragmenata umnožiti na kraju AFLP metode?

Answer 20

1 od 4096 fragmenata kada uzmemo u obzir sve vjerojatnosti i od umnažanja sa preselektivnim i od umnažanja sa selektivnim početnicama

Question 21

kakva se elektroforeza provodi kod AFLPa?

Answer 21

u denaturirajućim uvjetima u poliakrilamidnom gelu

Question 22

SSCP-puni naziv, princip metode

Answer 22

analiza polimorfizma konformacije jednolančane DNA

elektroforeza ssDNA u nedenaturirajućim uvjetima, DNA iste duljine, ali različitog redoslijeda nukleotida stvara različite sekundarne strukture koje utječu na brzinu migracije

Question 23

SSCP-postupak

Answer 23

1.priprema DNA:
-pomoću PCRa uz prisutnosz radioaktivnih nukleotida, nakon toga umnoženu DNA denaturiramo (zagrijavanje na 95 i naglo hlađenje u ledu)
-pomoću asimetričnog PCRa gdje koristimo dvije početnice s time da je jedna u suvišku tako da nakon što se potroši početnica koja je u manjem broju dolazi do sinteze samo jednog lanca
2.elektroforeza u poliakrilamidnom gelu pri NEdenaturirajućim uvjetima
3.detekcija autoradiografijom ili fluorescencijom- nije potrebno ako imamo jako puno DNA pa ju možemo vidjeti bez obilježavanja

Question 24

zašto koristimo SSCP?
šta je sa standardom i što nam omogućuje ili ne?

Answer 24

-koristi se za detekciju mutacije, ali ne možemo ovom metodom odrediti o kojoj se mutaciji radi, iz rezultata možemo vidjeti za koliko se nukleotida razlikuju dva uzoraka, IMAMO I KONTROLU
-iz standarda ne možemo zaključiti točnu veličinu fragmenata jer radimo ef u nedenaturirajućim uvjetima pa je migracija na temelju razlike u konformaciji

Question 25

DGGE-puni naziv, princip metode

Answer 25

elektroforeza u denaturirajućem agensu -ef dsDNA u gradijentu denaturirajućeg agensa (temperatura, urea, formamid) -dsDNA iste duljine, a različitog AT/GC sastava i redoslijeda nukleotida počinje se denaturirati na različitim mjestima u gelu -djelomična (lokalna) denaturacija usporava migraciju dsDNA

Question 26

DGGE-postupak

Answer 26

1.umnažanje kontrolne i ispitivane sekvence (gen) pomoću PCRa uz doatak bogate GC regije da sprječimo potpunu denaturaciju DNA- primeri imaju na svom 5'-kraju tag (ima puno GC) 2.ef u gradijentu denaturirajućeg agensa- oni fragmenti koji se brže denaturiraju sporije putuju kroz gel -onaj koji ima najviše AT brže se denaturira i sporije migrira -može se namjestiri ef da kad se uzorak dovoljno denaturira praktički stane u gel

Question 27

analiza heterodupleksa

Answer 27

1.kontrolnu i ispitivanu sekvencu umnožimo pomoću PCRa 2.denaturiramo umnožene DNA i sve zajedno pomiješamo 3.renaturacija- polako hladimo kako bi došlo do komplementarnog sparivanja različitih lanaca, ali i da spriječimo intralančano sparivanje -dobijemo pola homodupleksa pola heterodupleksa (nastala komplementarnim sparivanjem jednog lanca iz jednog PCRa i drugog lanca iz drugog PCRa) 4.analiza heterodupleksa (ef, sekvencioniranje, detekcija nesparenih baza enzimska ili kemijska), da bi detektirali mutaciju jer smo uspoređivali zdravu i tumorsku stanicu

Question 28

heterodupleksna DNA

Answer 28

sadrži nesparene ili krivo sparene baze

Question 29

FISH- puni naziv, svojstva

Answer 29

fluorescentna in situ hibridizacija analiziramo metafazne kromosome

Question 30

zašto koristimo FISH?

Answer 30

za analizu kariotipa, primjena i kod prenatalne dijagnostike detektiramo mutacije npr.recipročnu translokaciju

Question 31

FISH-postupak

Answer 31

1.uzmemo cijele stanice stavimo na stakalce mikroskopa, liziramo i onda metafazne kromosome vežemo na staklo 2.dodamo fluorescentne oligonukleotide koji se komplementarno sparuju- koristi se puno nukleotida da se spare sa cijelim kromosomom

Question 32

Mycobacterium tuberculosis-genom

Answer 32

sadrži neke ponovljene sekvence -MIRU lokus koji sadrži nekoliko ponovljenih sekvencija na više mjesta u genomu, taj broj ponavljanja varira, različiti sojevi imaju različit broj ponavljanja -sekvenca IS6110

Question 33

genotipizacija M.tuberculosis pomoću MIRU lokusa- postupak

Answer 33

1.MIRU lokuse umnožimo pomoću PCRa 2.ef, a kao strandar imamo DNA koja odgovara određenom broju ponavljanja

Question 34

genotipizacija M.tuberculosis pomoću sekevence IS6110- postupak

Answer 34

1.izolacija DNA 2.genom pocijepamo restrikcijskim enzimima 3.provedemo ef i dobijemo smear 4.provedemo Southern blot kako bi vizualizirali samo neke vrpce

Question 35

šta radimo kad imamo širenje neke bolesti/zaraze?

Answer 35

genotipizaciju uzročnika bolesti

Question 36

sekevncioniranje postupak

Answer 36

1.DNA koju želimo sekvencionirati prvo moramo pripremiti-4 reakcije specifične za svaku pojedinu bazu- reakcija ne smije biti 100% učinkovita da ne bi previše iscjepali DNA 2.vizualizacija DNA autoradiografijom ili fluorescencijom

Question 37

sastav reakcijske otopine za sekvencioniranje kod Sangerove metode

Answer 37

1.kalup (DNA koju želimo sekvencionirati- ssDNA ili denaturirana dsDNA) 2.klica-oligonukleotid koji je početnica za sintezu 3.DNA polimeraza (T7 sequenaza, Taq polimeraza) 4.pufer za DNA polimerazu (Mg2+, NaCl, pH) 5.dNTPovi i ddNTP

Question 38

označavanje kod Sangerove metode

Answer 38

radioaktivno: klica fluorescentno: klica ili ddNTP

Question 39

Sangerova metoda postupak

Answer 39

1.4 odvojene reakcije u svaku kivetu stavimo reakcijsku otopinu sa puno molekula kalupa i početnica 2.ef u poliakriamidnom gelu u denaturirajućim uvjetima, 1700V, urea, 68 stupnjeva 3.vizualizacija-radioaktivan je primer i zato ne vidimo kalup nego samo onaj lanac koji je nastao sintezom (sjeti se da su denaturirajući uvjeti kod ef)

Question 40

rezultat sekvencioniranja šta vidimo

Answer 40

najkraći fragmenti najbrže putuju pa po tome možemo zaključiti koliki je broj sekvencioniranih nukleotida sa lijeve strane se nalazi broj sekvencioniranih nukleotida čitamo od dolje prema gore

Question 41

razlike automatiziranog sekvencioniranja od klasičnog

Answer 41

-odvija se u jednoj kapilari, potreban je samo jedanuzorak, fluorescentno obilježeni su ddNTPovi, očitavanje se vrši pobuđivanjem fluorescencije -svaki novosintetizirani lanac na kraju ima fluorescentan ddnukleotid -svaki ddNTP emitira različitu valnu duljinu -na izlazu iz kapilare se očitava fluorescencija -bandovi prolaze kroz kapilaru od najmanjeg do najvećeg

Question 42

rezultat automatiziranog sekvencioniranja problemi?

Answer 42

-svaki pik pridružuje se jednom slovu -ako imamo slijed od istig nukleotida npr TTTT to može stvoriti problem u očitavanju rezultata

Question 43

o čemu ovisi kvaliteta signala kod automatiziranog sekvencioniranja?

Answer 43

o tome koliko je dobro DNA izolirana, koliko je dobro napravljen cijeli proces, ovisi i o samoj sekvenci ako imamo nekoliko ponovljenih istih nukleotida to može stvoriti problem kod očitavanja, ovisi i o udaljenosti od primera, prvih nekoliko nukleotida iza primera se loše očitavaju DOBRO OČITAVAMO SAMO 600/700 NUKLEOTIDA

Question 44

kemijska metoda sekvencioniranja-postupak

Answer 44

-mora biti obilježen samo jedan kraj npr sa fosfatazom i kinazom obilježimo 5'-kraj -4 odvojene reakcije sa specifično modificiranim nukleotidima zbog čega oslabi N-glikozidna veza i dolazi do njenog pucanja, tj. dolazi do izrezivanja baze iz DNA

Question 45

modificirane baze kod kemijskog sekvencioniranja

Answer 45

G: metilacija gvanina u položaju N7 pomoći dimetilsulfata G+A: apurinacija pomoću mravlje kisline C: hidrozin u prisutnosti NaCl cijepa samo citozin C+T: cijepanje pirimidinskih baza pomoću hidrazina

Question 46

kako se odvajaju modificirane baze kod kemijskog sekvencioniranja

Answer 46

koristi se piperidin, a zatim na abazičnim mjestima pucaju fosfodiesterske veze

Question 47

koja se ef provodi kod kemijske metode skevencioniranja

Answer 47

elektroforeza u akriamidnom gelu u denaturirajućim uvjetima, a detekcija autoradiografijom ili fluorescencijom