6.pred (2.dio)

Question 1

vektori podjela

Answer 1

plazmidni, virusni, virusno-plazmidni, umjetni kromosomi i ekspresijski vektori

Question 2

bakteriofag lambda genom

Answer 2

-dvolančana linearna DNA
-48,5 kb
-60 gena
-na krajevima je sekvencija cos dugi 12 pb

Question 3

virusni vektori

Answer 3

insercijski i supstitucijski

Question 4

insercijski vektor duljine u kb

Answer 4

lijeva ruka 16 kb
desna ruka 24 kb
insert do 11 kb (51-40)

Question 5

supstitucijski

Answer 5

lijeva ruka 22 kb
sredina 11 kb
desna ruka 8 kb

Question 6

plak

Answer 6

jedan plak je posljedica postojanja jednog infektivnog faga
bistra zona je mjesto gdje je infektirana bakterija e.coli

Question 7

pakiranje in vitro

Answer 7

-bakteriofag prvo inficira bakteriju i genom faga se ugradi u genom bakterije pa nastane lizogena bakterija
-najprije imamo dva soja bakterije e.coli, jedan soj je infektiran bakteriofagom lambda koji ima mutaciju u genu koji kodira za proteine kapside tako da će nakon indukcije litičkog ciklus nastati samo repovi
-drugi soj bakterije inficiran je sa bakteriofagom lambda koji ima mutacjiju u genu koji kodira za prot4ein repa i pakiranja i nakon indukcije litičkog ciklusa nastaje samo kapsira
-ta dva lizata bakterija pomiješamo zajedno sa DNA koju želimo klonirati i dodamo protein A (terminaza) koja prepoznaje i cijepa cos sekvencije i događa se bakiranje DNA uz utrošak ATP-a od cos do cos
-sa tim infektivnim česticama inficiramo novi soj bakterije e.coli i dobijemo plakove

Question 8

kozmidi šta sve ima

Answer 8

-plazmidi koji sadrže sekvenciju cos
-cijepanjem cos sekvencije nastaju kompatibilni jednolančani krajevi dugi 12 pb
-veličine 5-6 kb
-sadrži ishodište repl u e.coli, rezistencija na antibiotik, cos sekvencu, MCS
-veličina fragmenata od 34 do 46 kb

Question 9

kloniranje u kozmidu

Answer 9

kozmid se cijepa enzimo Bg/II
genomska DNA se parcijalno cijepa sa Sau3A

Question 10

zašto se ne cijepa u cos sekvenci

Answer 10

ako se ugradi insert između cos sekvenca onda više ne možemo pocijepati da dobijemo ljepljive krajeve, kao nije se obnovila cos sekvenca

Question 11

veličina fragmenta kod kozmida

Answer 11

34 do 46 kb

Question 12

vektori na osnovi faga P1 šta ima vektor

Answer 12

jedan dio: sekvencije pac i loxP
drugi dio: loxP i plazmidnu DNA (ori, rezistencija na kanamicin)

Question 13

pakiranje in vitro kod vektora na bazi faga P1

Answer 13

cijepanje DNA pomoću pakaze u regiji pac i u kapsidu se pakira 115 kb DNA

Question 14

pta spemamo u banku gena kod kloniranja pomoću plazmida na osnovi faga P1

Answer 14

bakterijske stanice

Question 15

kako se genom faga integrira u genom bakterije

Answer 15

mjesno-specifičnom rekombinacijom između sekvenca attP iz faga i attB iz bakterije, obje sekvence sadrže istu sredinu dugačku 13 pb

Question 16

loxP

Answer 16

sekevnca dugačka 34 pb, ima dva obrnuta ponavljanja duljine 13 pb odijeljena sekvencijom drljine 8 pb
ako su loxP sekvence okrenute u istom smjeru doći će do delecije što je ireverzibilno, ako su sekvence okrenute u suprotnom smjeru doći će do inverzije gena što je reverzibilno

Question 17

jednolančana DNA koristi se za

Answer 17

sekvencioniranje, pripremu označene DNA, in vitro ciljana mutageneza po Kunkelu

Question 18

genom filamentoznih jenolančanih DNA virusa

Answer 18

jednolančana kružna DNA molekula, 6,4 kb, ima oko 11 gena i IGR regiju zaslužnu za replikaciju i pakiranje DNA

Question 19

kojeg je genotipa bakterija koju inficiraju jednolančani filamentozni DNA viruso

Answer 19

F’[proAB+] delecijaproAB u genomu
kako bi se osigurali tijekom selekcije da stanice imaju faktor fertilnosti, bakterije koje rastu na podlozi bez prolina sigurno imaju faktor fertilnosti

Question 20

za što koriste filamentozni fagi bakteriju

Answer 20

za umnažanje i ne liziraju bakteriju, iz jedne bakterijske stanice nastanu 1000 novih virusnih, bakterija onda ima produljeno generacijsko vrijeme

Question 21

helper fag

Answer 21

-filamentozni jednolančani DNA virus koji je genetički modificiran, ima mutaciju u IGR regiji i zbog toga ima smanjenu uspješnost replikacije i pakiranja, u virusne čestice se puno češće pakira fagmid nego genom helper faga
-potreban je i zbog toga jer ima sve virusne gene za ptoteine koji su nam potrebni da se naš plazmid pakira u jednolančanom obliku

Question 22

kako izoliramo fagmid na kraju postupka sa helper fagom

Answer 22

suspenziju centrifugiramo i u talogu su bakterijske stanice, a u supernatantu virusne sa željenim fagmidom, onda iz virusa izoliramo plazmid u jednolančanom obliku

Question 23

kako razdvojiti naš plazmid od genoma bakteriofaga (kod izolacije fagmida u jednolančanom obliku)

Answer 23

elektroforezom, pošto su obje DNA jednolančane i velika je vjv da su različite onda iz gela izoliramo željenu DNA

Question 24

BAC što sve sadrži

Answer 24

osnova je F-faktor E.coli, ishodište replikacije, sekvencije odgovorne za pravilnu segregaciju, rezistencija na antibiotik, cos, loxP, promotori, terminatori, kloniranje u lacZ ili sucB

Question 25

sucB

Answer 25

kodira za enzim koji hidrolizira saharozu i sintetizira polisaharid levan, a on je toksičan za e.coli

Question 26

YAC što sve sadrži

Answer 26

ARS, CEN, TEL, TRP1, URA3, HIS4, SUP4 (MCS unutar SUP4), ori i bla može se replicirati i u e.coli i u s.cerevisiae

Question 27

za šta kodira SUP4

Answer 27

za tRNA koja suprimira mutaciju u ade2, ta tRNA čita STOP kodon kao tirozin ade2 ima mutaciju koja je uzrokovala pojavu STOP kodona (nonsense mutacija- frame shift mutacija ili supstitucij)

Question 28

ade2

Answer 28

kodira za protein Ade2 ako je gen funkcionalan sintetizira se protein Ade2 i kolonije su bijele boje ako je gen mutiran, tj mutacija u biosintetskom putu adenina uzrokuje nakupljanje crvenog pigmenta

Question 29

kakve će stanice biti aako je SUP4 aktivan, a kakve ako je inaktivan

Answer 29

ako je aktivan stanice će biti bijele boje ako je inaktivan stanice će biti crvene boje

Question 30

kloniranje u YACovima

Answer 30

1.restrikcija u MCS i izrezivanje HIS 2.uklanjanje HIS4 preparativnom elektroforezom 3.ligacija lijeve i desne ruke kromosoma sa insertom 4.sa ligacijskom otopinom transformiramo kvasac određenog genotipa- delecija ura3, trp1, his4 i mutaciju u ade2

Question 31

elekcija transformanata kod YACa

Answer 31

prvo na podlozi bez uracila i triptofana i sa histidinom transformanti sigurno sadrže obje ruke provjera na podlozi bez histidina da provjerimo jesmo li dobro linearizirali YAC

Question 32

veličina inserata kod BACa i YACa

Answer 32

BAC do 300 kb YAC 200 do 2000 kb

Question 33

ekpresijski vektori karakteristike

Answer 33

DNA koja se eksprimira mora biti pod regulacijom promotora koji mogu biti viralni, bakterijski, animalni ili biljnji

Question 34

promotori kod ekspresijskih vektora

Answer 34

mogu se nalaziti s obje strane MCSa pa možemo po želji vršiti transkripciju jednog ili drugog lanca aktiviramo samo jedan promotor pa radimo transkripciju jednog lanca ili sa druge strane radimo transkripciju drugog lanca

Question 35

na kojem lancu DNA se nalaze terminatori i promotori

Answer 35

na kodirajućem lancu DNA 5'-promotor 3'-terminator

Question 36

inducibilni promotori

Answer 36

možemo pojačati razinu ekspresije kako mi želimo jer nekada kada stavimo željenu DNA pod regulaciju prejakog promotora to iscrpi stanicu što može uzrokovati smrt stanice

Question 37

primjeri inducibilnih promotora

Answer 37

-sintetski trc promotor (trp+lac)-indukcija IPTGom -PL promotor bakteriofaga lambda pod kontrolom represora cl koji je pod kontrolom trp promotora, dodatkom triptofana reprimira se sinteza cl represora i dolazi do indukcije ekspresije kloniranog gena -promotor operona araBAD-eskpresija regulirana udjelom glukoze i arabinoze u podlozi (prisutnost arabinoze aktivira transkripciju, a odsutnost reprimira)

Question 38

his-tag

Answer 38

može biti dio ekspresijskog vektora ili se može dodati PCRom sadrži i mjesto za proteolitičko cijepanje da bi mogli ukloniti his tag sa izoliranog proteina

Question 39

posebni vektori koji omogućuju kloniranje rekombinacijom in vitro mogu sadržavati sekvencije:

Answer 39

att koju prepoznaje integraza kod bakteriofaga lambda FRT koju prepoznaje rekombinaza Flp iz kvaca loxP koju prepoznaje rekombinaza Cre iz bakteriofaga P1