4.pred Flashcards
DNA-ligaze
enzimi koji stvaraju fosfodiesterske veze u molekuli DNA između 5’-fosfatne i 3’-hidrokdilne skupine
knjižnica gena, banka gena
skup klonova (najčešće bakterije e.coli ili kvasca S.cerevisiae) koji sadrže vektore (najčešće plazmide ili umjetne kromosome) u kojima su klonirani (ugrađeni, insertirani) svi ili gotovo svi fragmenti genoma nekog organizma - u jednom klonu u pravilu se nalazi jedan fragment genoma
cDNA banka
sadrži kodirajuću DNA (ORFove) nekog organizma
genomska banka
sadrži kodirajuću i nekodirajuću DNA
banka gena je potpuna ako?
ako je u njoj sadržan željeni dio genoma (npr. cjelokupna cDNA ili cjelokupni genom)
RNaze
RNaza A, RNaza H
DNaze
DNaza 1, Bal 31, S1 nukleaza, egzonukleaza III
DNA polimeraze
DNA polimeraza I, Klenow fragment, Taq polimeraza, reverzna transkriptaza
ostali enzimi nabroji
RNA polimeraza, polinukleotid fosfataza i kinaza, terminalna deoksinukleotidil transferaza,
RNaza A
-izolirana iz goveđeg pankreasa
-endonukleaza
-aktivost: cijepa fosfodiestersku vezu u jednolančanoj RNA ostavljajući 3’-fosfatnu grupu na pirimidinskim nukleotidima (iza U i C)
-primjena: uklanjanje RNA pri izolaciji plazmidne ili genomske DNA, RNA ostane u supernatantu, a DNA u talogu
RNaza H
-izolirana iz bakterije E.coli
–cijepa RNA do kratkih oligonukleotida i to samo ako se RNA nalazi u DNA/RNA hibridu
-primjena: priprema cDNA
S1 nukleaza
-izolirana iz plijesni Aspergillus oryzae
-hifrolizira i ssDNA i ssRNA do 5’-fosforil mono- ili oligonukleotida, ali ima 5x veću aktivnost na DNA nego na RNA, ako se nalazi u suvišku hidrolizira i ds DNA, najslabiju aktivnost ima na DNA/RNA hibridu
-aktivna je pri niskom pH (4,5) i u prisutnosti Zn2+
-primjena: uklanjanje jednolančane DNA s krajeva dvolančanih fragemenata i S1 mapiranje
S1-mapiranje
metoda koja se koristi za određivanje broja i duljine egzona u nekom genu
BAL 31
hidroliziraa DNA do 5’-fosforil-mononukleotida
egzonukleazna akrivnost prema dsDNA (hidrolizira 5’- i 3’-kraj)
primjena: skraćivanje dsDNA na njenim krajevima; detekcija promotora
DNaza I
-izolirana iz goveđeg pankreasa
-aktivnost endonukleaza koja hidrolizira jednolančanu i dvolančanu DNA ostavljajući fosfatnu skupinu na 5’-kraju
-aktivnost joj ovisi o prisutnosti Ca2+, a može se modulirati prisustvom Mg2+ (MgCl2) i Mn2+ (MnCl2)
-Mg2+ - nasumice uvodi jednolančane lomove
-Mn2+ - nasumično uvodi dvolančane lomove (djeluje kao nespecifični restrikcijski enzim)
primjena DNaze I
uz prisustvo Mn2+: fragmentiranje dsDNA (priprema knjižnice gena)
uz prisustvo Mg2+ : uvođenje jednolančanih lomova (supstrat za DNA polimerazu I) što je korisno kod radioaktivnog obilježavanja, u velikim koncentracijama potpuno hidrolizira DNA (izolacija RNA i uklanjanje kalupa nakon in vitro transkripcije), istraživanje interakcije DNA i proteina (“DNaze I footprinting) mogu se detektirati sekvence DNA ns koje se veže određeni protein jer DNaza ne može
egzonukleaza III
-izolirana iz bakterije E.coli
-aktivnost: 3’-5’-egzonukleazna aktivnost na dsDNA
-aktivna je na jednolančanim lomovima, ravnim krajeima i isturenim jednolančanim krajevima (nije aktivna na 3’-isturenim krajevima duljim od 3 nukleotida ni ssDNA)
-primjena: skraćivanje linearnih fragmenata dsDNA na samo jednom kraju i pripređivanje jednolančane kružne DNA
DNA polimeraza I
-izolirana iz bakterije e.coli
-jedan polipeptidni lanac
-C-terminalni dio ima 5’-3’-nukleaznu aktivnost
-N-terminalni dio nema 5’-3’-nukleaznu aktivnost, a ima 3’-5’-polimeraznu aktivnost
-i DNA pol I i Klenow fragment koriste se za označavanje DNA
Taq polimeraza
-izolirana iz Termus aquaticus, rekombinantna iz E.coli
-DNA ovisna DNA-polimeraza
-za sintezu je potrebno imati DNA kalup, klica sa slobodnom 3’-OH skupinom, dNTPovi, pufer sa Mg2+
-nema 3’-5’-egzonukleaznu aktivnost
-ima jako slabu 5’-3’-egzonukleaznu akticnost
-ostavlja 3’-istureni dA
-primjena: PCR, AT-kloniranje
reverzna transkriptaza
-RNA ovisna DNA-polimeraza
-izolirana iz retrovirusa; modificirana i klonirana u E.coli
-upotreba: konstrukcija cDNA biblioteke (dobijemo dsDNA koja je kodirajuća pa ju možemo klonirati u plazmide)
upotreba DNA-polimeraze i DNaza
-sinteza DNA prema kalupu (obilježavanje DNA)
_pretvaranje 5’ i 3’-krajeva u ravne krajeve
-PCR (Taq)
-cDNA
fosfataza
uklanja fosfatnu skupinu sa 5’-kraja ss i ds DNA i RNA
polinukleotid kinaza
katalizira prijenos gama fosfata s ATP na 5’-OH skupinu ss i ds RNA i DNA
primjena fosfataze i kinaze: radioaktivno obilježavanje 5’-ktaja i sprječavanje religacije vektora
terminalna polinukleotidil transferaza
-izolirana iz goveđeg timusa
-polimerizira deoksinukleotide na slobodnu 3’-OH skupinu ss i ds DNA
-primjena: obilježavanje 3’-kraja
-izrada knjižnice gena (fragmentiranje genoma sa DNaza I, na fragmente se doda poli-dA, a na linearizirane plazmide poli-dT
-nije prava polimeraza jer joj nije potreban kalup
