16. Fehérjetartalom: közvetlen fehérje meghatározási módszerek.

Question 1

Közvetlen fehérjemeghatározás lényege

Answer 1

• • a fehérjelánc nem bomlik fel, nincs roncsolás
• • oldatban meghatározás –> oldatba nehéz vinni –> ritkán a teljes fehérjemennyiséget határozzuk meg, inkább egyes tulajdonságokat, oldatban lévő fehérjék mennyiségét

Question 2

Közvetlen fehérjetartalom mérés módszerek

Answer 2

A. Gravimetriás meghatározás
B. Spektrofotometriás meghatározás (UV)
1. UV spektrofotometria
2. Kolorimetriás meghatározás
--> Biuret-módszer
--> Folin-Ciocalteau-reakció
--> Turbidimetria
--> Fluorimetria
--> Infravörös spektroszkópia

• -> színezékkötés alapján
• -> Ninhidrin
• -> Bradford
• -> Refraktometria

Question 3

Gravimetriás meghatározás

Answer 3

1. sikérfehérje (glutén) meghatározása leginkább
2. folyékony élelmiszer: oldott fehérjéket tanninnal csapjuk ki –> szűrés, mosás (tisztítás, osz. maradványok eltávolítása) majd gravimetriás mérés

Question 4

UV spektrofotometria

Answer 4

191-194 nm –> peptidkötés, de nagyon érzékeny
224-240 nm –> fehérjéknek nem abszorpciós maximum, de nukleinsavaknak minimum
280 nm –> tirozin, triptofán abszorpciós maximuma (nukleinsavak zavarhatnak)

Question 5

Kolorimetriás mérések alapja

Answer 5

fehérje + reagens –> színes származék –> abszorbancia mérés

Question 6

Fluorimetria

Answer 6

1. fehérjéhez fluoreszcens vegyületet kapcsolunk (pl.: eozin Y)
   vagy
2. fluoreszkáló vegyület fluoreszcenciájának kioltása fehérje hozzáadásával

Question 7

Turbidimetria

Answer 7

fehérje kicsapása a híg oldatból –> lebegő részecskék
kicsapáshoz: tannin, triklórecetsav vagy sók: NaCl, ammonium szulfát, Na-szulfát

A fényszórást mérjük –> részecskeszámmal arányosan nő

Question 8

Biuret reakció

Answer 8

Cu2+ ionok lúgos közegben 4 peptidkötéssel (N-el) koordinációs komplexet képeznek –> sephadex gélen különválasztjuk ezeket a kis molekulatömegű anyagoktól –> a Cu2+ mennyiségét határozzuk meg

detektálás: 540-560 nm-en

előny: gyors, automatizálható, mennyiségi meghatározás

hátrány: mintaelőkészítés, zavaró komponensek

Question 9

Folin-Ciocalteau-reakció

Answer 9

Tirozincsoportok lúgos közegben kék színnel reagálnak –> koordinációs komplexet képeznek –> fotometriás meghatározás

Detektálás: 700 nm-en

előny: gyors, automatizálható, mennyiségi meghatározás

hátrány: mintaelőkészítés, zavaró komponensek (redukáló cukrok zavarnak, Cu2+al lehet a zavaró hatásukat csökkenteni)

Question 10

IR

Answer 10

NIR

fehérjék, peptidkötések karakterisztikus elnyelési sávjaiból határozunk meg fehérjéket

Question 11

színezékkötés

Answer 11

fehérjék szekunder funkciós csoportjai (általában bázikus csoportok) –> disszociáltan képesek savas jellegű színezékeket sókötéssel megkötni –> csapadék képződik
–> színezék koncentrációt mérik abszorbanciával

Question 12

Ninhidrin

Answer 12

fehérje primer aminocsoportja + ninhidrin karbonilcsoportja –> Schiff-bázis

Question 13

Bradford

Answer 13

fehérje savas csoportja –> festék N csoportja

vörösből kék színű lesz –> abszorbancia mérés