17. Fehérjék aminosav összetételének meghatározása, szabad aminosavak és biogén aminok analitikája.

Question 1

fehérjék aminosav összetétele

Answer 1

20 féle alfa-L-aminosav –> leginkább L konfiguráció a természetben (optikailag aktívak, képesek elforgatni a poláros fény rezgési síkját)

1-1 amino- és karboxilcsoport
és R oldallánc

Question 2

aminosavak csoportosítása R oldalláncuk szerint

Answer 2

1. töltés nélküli nem poláris:
gav lip mft
glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, metionin, fenilalanin, triptofán
2. töltés nélküli poláris:
szerin, cisztein, treionin, tirozin, aszparagin, guanin
3. savas, negatív töltés: 
aszparaginsav, glutaminsav
4. bázikus, pozitív töltésű: 
Lys, Arg, His

Question 3

Táplálkozás-biológiai szempontból megkülönböztetés

Answer 3

esszenciális aminosavak: táplálékkal kell felvenni, szervezet nem tudja előállítani

vli mft, Treonin, Lys, Arg, His

emészthető (hús, növény), emészthetetlen (haj)

Question 4

aminosavak töltése

Answer 4

savas pH-n –> COOH csoport nem tudja leadni a H+ ionját –> NH2 felveszi –> pozitív töltés

lúgos pH-n –> negatív töltés, COOH leadja a H+ ionját

semleges –> ikerionos szerkezet az izoelektromos ponton, kifelé semleges, pozitív és negatív vég is

Question 5

aminosavak reakciói

Answer 5

1. ninhidrines reakció NH2-vel –> kékes-ibolyás színű (570 nm en nyel el)
   prolinnal sárga színű, 440 nm-en nyel el
2. naftokinon-szulfonsav: vörös
3. Cu2+ vegyületekkel semleges pH-n mélykék szín

Question 6

Aminosav összetétel meghatározása előtti mintaelőkészítés - hidrolízis

Answer 6

tömény savval vagy lúggal, utána visszamaradt O2-t N2 átbuborékolásával lehet eltüntetni

hidrolízis fajták:

1. savas
2. lúgos
3. oxidációs savas hidrolízis
4. p-toluol-szulfonsavval

Question 7

1. Savas hidrolízis

Answer 7

6 M HCl
100-120 fok
16-48 h

előny: HCl illékony –> hidrolízis után eltávolítható

hátrány: néhány aminosav bomlik: Triptofán teljesen, és Ser és Treionin részlegesen (pár peptidkötés is csak részlegesen)

Question 8

2. Lúgos hidrolízis

Answer 8

triptofán meghatározására, sok aminosav károsodik lúg hatására

4 M NaOH (vagy Ba(OH)2)
110 fok
5-20 h

Question 9

3. Oxidációs savas hidrolízis

Answer 9

kéntartalmú aminosavak meghatározása (pl.: Cys, Met)

oxidálószerek: perhangyasav, dimetil-szulfoxid
oxidáció után savas hidrolízis

Question 10

4. p-toluol-szulfonsav

Answer 10

valamennyi aminosav meghatározására

3 M p-toluol-szulfonsav + 0,2% triptamin (triptofán megvédésére)
110 fok
22 h

Question 11

szabad aminosavak kinyerése

Answer 11

extrahálószerek: alkoholos oldat, vizes puffer (pH 2-4), fehérjekicsapószer oldat (előny –> a fehérjék a mintából nem oldódnak ki) –> 10% triklór-ecetsav, 5-6% perklórsav, 5-10% szulfo-szalicilsav

Question 12

Szabad aminosav meghatározási módszerek

Answer 12

VRK, Ioncserés-kromatográfia

elektroforetikus technikák, HPLC

Question 13

VRK

Answer 13

állófázis:
szilikagél, cellulóz–> futtatószer: n-butanol, ecetsav, víz elegy

előhívás: ninhidrinnel

nagy teljesítményű VRK –> HPTLC

• • kényszeráramlásos RK –> nem a kapilláris erők miatt áramlik a folyadék (nyomás, elektromos tér hatására)
• • túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) –> síkban

Question 14

Ioncserés oszlopkromatográfia

Answer 14

folyadékkromatográfia
állófázis: pl.: polisztirol alapú ioncserélő gyanta
mozgófázis: vizes oldat (puffer)

az elválasztandó alkotók 2 fázis közötti megoszlását az ioncsere-egyensúly szabja meg (só koncentrációtól és az eluens pHjától függ)

kromatogrammon
minőség: retenciós idő
mennyiség: csúcs alatti terület összesen

Question 15

gradiens elúció

Answer 15

gradiens elúció: a mozgófázis összetételét a mérés közben változtatom –> pl.: pH 3-tól 10ig emelés –> aminosavakat egy kationcserélő oszlopra kötjük, a mintát az oszlopba injektáljuk, az aminosavak sorban leoldódnak

ninhidrinnel előhívjuk

Question 16

Biogén aminok

Answer 16

aminosavak dekarboxileződésével jön létre

néhányuk ingerületátvivőként működik (szerotonin, hisztamin)

VRK, HPLC, kapilláris elektroforézissel meghatározhatóak

pl.: alfa/béta-alanin, szerotonin, hisztamin, triptamin

Question 17

mintaelőkészítés

Answer 17

puffer komponensek (sók, detergensek, urea) eltávolítása, hogy ne zavarják a későbbi mérést:

1. fehérje extrakció után illékony szerves oldószerrel vonjuk ki az extrakciós közegből (f.f. extrakció) –> vákuum centrifugával szárítás
2. Dialízis (féligáteresztő membránnal) az extrakciós oldatot illékony puffer vagy víz ellenében
3. Ultraszűrés: puffercsere
4. fehérjekicsapás a pufferből organikus oldószerrel (pl.: acetonnal)
5. Gél szűrés