7. Transcriptie - prokaryoot Flashcards
(32 cards)
belangrijkste dna-rna verschillen
- 2’ OH groep -> reactiever
- kan geen B helix vormen
- bouwt Uracil in
- enkelstrengig, tenzij intramoleculaire complementariteit maar dan zal dat volgens het A-helix model zijn
structuurniveau’s van RNA
- primaire structuur; nucleotidepolymeer
- secundaire structuur; hairpin, stem loop
- tertiaire structuur; bv pseudoknot
- quaternaire structuur; in complex met meestal eiwitten -> RNPs
hoe noem je rna in complex met eiwitten
- ribonucleoproteinecomplexen
waarom zijn er heel veel genen die niet voor eiwitten coderen
deze coderen voor functionele, niet coderende rna’s
- bv: snRNA, snoRNAs, tRNA, miRNA, siRNAs, rRNA
wat waren de twee hypothesen rond ribosomen
- per mRNA werd een bijbehorend ribosoom gemaakt dat specifiek voor dat mRNA was, en dus ook maar 1 type eiwit kon maken
- alle ribosomen zijn hetzelfde en kunnen alle mRNAs aflezen
wat wilden Jacob, brenner en meselson bewijzen met hun experiment + wat was op voorhand gekend
- dat dna naar een onstabiel rna intermediair wordt omgezet
- dat er geen specifieke ribosomen worden aangemaakt
- dat dit rna associeert met ribosomen
op voorhand:
- dna is de drager van het erfelijk materiaal
- dna wordt omgezet in eiwit
- ribosomen zorgen voor eiwitsynthese
- rna is mogelijks de link tussen beiden
experiment van jacob, brenner, meselson
- e coli opgroeien in zware isotopen: N15 en C13
- de ribosomen zijn nu zwaar
- dit wordt met densiteitscentrifugatie gevisualiseerd
- de bacteriën worden naar een medium met ‘normale’ isotopen overgebracht en meteen met bacteriofagen geinfecteerd
- visualisatie van de ribosomen toont geen shift in de gradient
- vervolgens voegt met radioactief P toe om rna te visualiseren
- dit P wordt ingebouwd in het rna dat de bacterie aanmaakt
- visualisatie toont dat de radioactiviteit thv de zware ribosomen zit in de gradiënt wat hun interactie suggereert
- bovendien hybridiseert dit rna enkel met het dna van de faag, het is dus niet van de bacterie afkomstig
resultaten en conclusie van het experiment van jacob, brenner, meselson
- bacteriofaag injectie induceert de vorming van een rna intermediair, dat enkel met faag dna hybridiseert en dus niet van de bacterie komt
- dit rna intermediair complexeert met oude ribosomen; er word dus geen code geïnjecteerd die specifieke ribosomen voor het faag rna maakt
conclusie: rna is de boodschapper, ribosomen zijn universeel
wat is een belangrijk verschil tussen dna en rna polymerase
- rna polymerase heeft geen primer nodig
algemene stappen in transcriptie
- rna polymerase bindt thv tts
- vorming van transcriptiebubbel
- van 5’ -> 3’ worden rNTPs ingebouwd
- thv transcriptie stop site koppelt het polymerase los
verschillen transcriptie en replicatie
- geen primer nodig
- conservatief
-unidirectioneel
parallellen replicatie en transcriptie
- polymerisatie van 5’ -> 3’
- initiatie, polymerisatie, terminatie
- regulatie gebeurt vnl thv initiatiestap
welke nummer krijgt de transcriptie start site
+1
wat is het idee achter DNasel footrprinting
- achterhalen waar eiwitten op het dna binden
- zoals bv een promotor regio vinden
- gecombineerd met Sanger krijg je dan informatie over de sequentie op nucleotidenniveau, naast lokalisatie
footprinting principe
- je merkt het dna fragment waarvan je vermoed dat deze een eiwitbindende regio bevat
- aan 1 kant -> anders krijg je overlappende signalen en is het niet mogelijk de footprint te interpreteren
- je incubeert met eiwit, bv rna polymerase
- je voegt DNase I toe, dit zal willekeurig het dna verknippen, behalve waar eiwit gebonden is
- deze fragmenten scheidt je obv grootte met gelelektroforese
- je ziet een footprint: een afgeschermd gebied omdat hier eiwitten binden
functionele eenheden van de promotor
- cis element: eiwit bindende sequentie
- trans factoren : dna bindende eiwitten
wat bepaalt de efficiënte of frequentie van de transcriptie-initiatie bij prokaryoten
- de mate waarin de -35/-10 gebieden in de promotor de consensus sequentie benaderen
- promotorregios zijn geen geconserveerde sequenties maar thv die twee regio’s is er een consesussequentie; bepaalde nucleotiden komen daar frequent voor omdat ze een functioneel belang hebben
- de consesussequentie is de ‘optimale’ sequentie
prokaryoot RNA polymerase
core enzyme:
- katalytische eenheid
- zorgt voor polymerisatie, terminatie
- 2 alfa subunits
- b en b’ subunit
- omega subunit: deze dient enkel voor stabilisatie van het enzymcomplex
sigma factor:
- essentieel voor initiatie
- herkent en bindt promotor
waar bindt de sigma factor en wat impliceert dit
- thv -35/-10 regio’s
- hoe meer die regio’s overeen komen met de consensus sequentie; hoe beter deze interactie is en hoe hoger de transcriptie-initiatie frequentie
welke trans factoren reguleren de transcriptie-initiatie
- sigma factoren: per type promotor is er een ander type
- repressoren
- activatoren
hoe zorgen repressoren voor negatieve regulatie bij prokaryoten
- binden thv de operator, een regio die overlapt met het promotor gebied waar rna polymerase bindt
- zorgen voor sterische hinder
hoe kan je naast DNaseI footprinting nog aantonen dat eiwitten op dna binden
- EMSA
= electrophoretic mobility shift assay - je labeled het dna
- je incubeert met het eiwit
- je visualiseert met gel elektroforese
waarom is het prokaryoot genoom zo efficiënt
- geen intergenische regio’s of repeats
- meerde types sigma factoren, die elk bij een type promotor horen
- transcriptie eenheden zijn polycistronisch; bevat meerdere genen die in 1 transcript terechtkomen maar wel aanleiding geven tot verschillende eiwitten, die in hetzelfde metabole proces betrokken zijn
hoe zijn genen bij prokaryoten georganiseerd
- in operons
- promotor, met hierin ook de operator
- meerdere genen -> polycistronisch
- meerdere genen staan onder 1 promotor
