Blotting di acidi nucleici Flashcards
(9 cards)
Blotting
Il SOUTHERN BLOTTING è un sistema che permette di studiare la STRUTTURA e l’ORGANIZZAZIONE del GENOMA, mentre il NORTHERN BLOTTING permette di studiare i LIVELLI di ESPRESSIONE GENICA.
Il SOUTHERN BLOTTING coinvolge il TRASFERIMENTO SU MEMBRANA di DNA mentre il NORTHERN BLOTTING coinvolge il TRASFERIMENTO SU MEMBRANA dell’RNA.
Per realizzare questi blotting bisogna partire con un’ELETTROFORESI, quindi gli ACIDI NUCLEICI devono essere SEPARATI mediante ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO. Gli ACIDI NUCLEICI (sia DNA che RNA) vanno TRASFERITI su MEMBRANA in un processo di BLOTTING. Il RICONOSCIMENTO del GENE o della PORZIONE DI DNA di interesse viene realizzato mediante l’IBRIDAZIONE con una SONDA MARCATA
Southern blotting
E’ possibile sapere QUANTE COPIE di un GENE ci sono all’interno del GENOMA di un qualsiasi essere vivente. Quindi la domanda a cui si può rispondere con questa tecnica è quella di capire come può essere ORGANIZZATO il GENOMA
Procedura
La prima cosa da fare è DIGERIRE l’ACIDO NUCLEICO con degli ENZIMI DI RESTRIZIONE che RICONOSCONO delle SPECIFICHE SEQUENZE di DNA e TAGLIANO in corrispondenza di quelle SEQUENZE. Possono realizzare dedi TAGLI con ESTREMITA’ SFALSATE o BLUNT.
Ogni ENZIMA è SPECIFICO per delle particolari SEQUENZE del DNA. Di norma la LUNGHEZZA di queste sequenze è di 4, 6 o anche 8 BASI, comunemente è di 6 BASI ma ci sono enzimi che riconoscono sequenze di 4 basi e taglieranno più frequentemente nel genoma e altri enzimi che sono specifici per sequenze di 8 basi e taglieranno meno frequentemente all’interno del genoma. Mediamente la maggior parte degli enzimi di restrizione riconoscono sequenze di 6 basi.
Nel momento in cui si deve sapere QUANTE COPIE di un GENE SPECIFICO ci sono all’interno del GENOMA di riferimento nell’approntare la reazione di DIGESTIONE ENZIMATICA si devono selezionare ENZIMI che NON TAGLIANO all’INTERNO del GENE altrimenti il risultato ottenuto potrebbe risultare totalmente FALSATO.
Per cui la prima cosa che si fa è quella di realizzare una MAPPA DI RESTRIZIONE del GENE. Ci sono dei semplici SOFTWARE in rete che, inserita una SEQUENZA di DNA di interesse, consentono di sapere in un attimo quali sono tutti gli ENZIMI che TAGLIANO all’INTERNO della SEQUENZA.
Per la DIGESTIONE del DNA si utilizzano ENZIMI che NON TAGLIANO all’INTERNO della SEQUENZA
EcoR1: elettroforesi su gel
Si immagina di aver scelto l’ENZIMA EcoR1 per DIGERIRE il DNA.
I nomi degli enzimi di restrizione sono particolari, l’acronimo è riferito all’organismo da cui è stato isolato l’enzima: Eco fa riferimento a Escherichia coli e i numeri fanno riferimento al ceppo, al laboratorio che ha isolato quell’enzima.
EcoR1 compie dei TAGLI RANDOM all’interno dell’ACIDO NUCLEICO ma NON DIGERISCE all’interno del GENE. Si ottengono una serie di FRAMMENTI che devono essere SEPARATI tramite ELETTROFORESI SU GEL. In ogni POZZETTO del GEL è stato CARICATO lo STESSO DNA ma DIGERITO con ENZIMI DIFFERENTI, talvolta si utilizzano anche COMBINAZIONI di ENZIMI. Si presenta come una STRISCIATA nella quale a volte si possono vedere delle BANDE PIU’ FOCALIZZATE. La STRISCIATA è indice di DIGESTIONE del DNA, cioè sono stati ottenuti tanti FRAMMENTI di DIMENSIONI SIMILI tra loro che nel momento in cui si vanno a SEPARARE NON FOCALIZZANO come delle belle bande (a meno che non ce ne sia una quantità elevata di una certa dimensione), ma si vedono come una STRISCIATA che testimonia il fatto che il DNA è stato DIGERITO.
Di norma un DNA GENOMICO NON DIGERITO ENTRA POCO all’interno del GEL perché ha delle DIMENSIONI tali per cui anche facendo dei GEL DI AGAROSIO a MAGLIE ABBASTANZA LARGHE, esso si presenta come una SINGOLA BANDA di ALTO PM
Caricamento marcatori nel gel
In questo gel si CARICANO anche dei MARCATORI di PM, sono dei FRAMMENTI di DNA a PM NOTO che servono per definire la POSIZIONE e il PM dei FRAMMENTI di DNA che al TERMINE di questa operazione di southern blotting avranno IBRIDIZZATO con la SONDA.
La CORSIA dove sono stati CARICATI i MARCATORI prima del trasferimento su membrana viene TAGLIATA dal GEL dal momento che i MARCATORI tendono ASPECIFICAMENTE a LEGARE la SONDA DI IBRIDAZIONE che viene utilizzata. Quindi questa lane viene rimossa, ma PRIMA si deve fare una FOTO del GEL sul quale si poggia anche un RIGHELLO con lo 0 che corrisponde alla POSIZIONE dei POZZETTI dove è stato caricato il campione. Questa foto con l’aiuto del righello serve poi al TERMINE di tutto il processo di trasferimento e rivelazione delle bande di interesse per capire il PM delle BANDE in riferimento alla POSIZIONE dei MARCATORI di PM che NON saranno più sul GEL
Denaturazione
A questo punto si RIMUOVE la CORSIA relativa ai MARCATORI e si pone il GEL in una SOLUZIONE di DENATURAZIONE che è costituita da 0.5M NaOH e 1M NaCl, quindi è una DENATURAZIONE che avviene in CONDIZIONI ALCALINE.
Questa DENATURAZIONE SEPARA i DUE FRAMMENTI del DNA perché se so considera che poi si deve IBRIDIZZARE il DNA con una SONDA, quindi con un FRAMMENTO di DNA che in maniera COMPLEMENTARE RICONOSCE il GENE di interesse, il DNA deve essere a SINGOLO FILAMENTO perché se fosse a DOPPIO FILAMENTO la SONDA NON troverebbe una REGIONE DI COMPLEMENTARITA’
Depurinazione
Talvolta può essere realizzato uno step di DEPURINAZIONE in HCl 0.25N per 10 MINUTI.
Questo step di depurinazione ha la funzione di DEPURINARE, quindi STACCARE le BASI PURINICHE dal DNA, e questi SITI DEPURINATI diventano SUSCETTIBILI all’IDROLISI.
Lo step di depurinazione viene realizzato quando la DIGESTIONE del DNA NON è stata particolarmente EFFICACE quindi magari l’enzima che è stato utilizzato ha lasciato un’elevata percentuale di DNA di alto PM. Siccome i FRAMMENTI di ALTO PM NON si TRASFERISCONO , lo step di depurinazione serve per FRAMMENTARE il DNA in FRAMMENTI PIU’ PICCOLI che si TRASFERISCONO MEGLIO.
Questo step è FACOLTATIVO, viene deciso sulla base del GEL.
Se si vede che la QUANTITA’ di DNA rimasto di ELEVATE DIMENSIONI è molto ALTA, si può prima DEPURINARE e poi DENATURARE il DNA
Neutralizzazione
Dopo lo step di DENATURAZIONE che dura circa 15-20 MINUTI di INCUBAZIONE del GEL all’interno della soluzione di NaOH e NaCl, si fa uno step di NEUTRALIZZAZIONE cioè si TRASFERISCE il GEL in un’altra SOLUZIONE che riporta il pH a dei VALORI intorno alla NEUTRALITA’ perché la SOLUZIONE DI DENATURAZIONE essendo costituita da 0.5M NaOH ha un pH estremamente BASICO.
Quindi la neutralizzazione riporta la SOLUZIONE ad un pH FISIOLOGICO
Trasferimento su membrana
A questo punto si può fare il TRASFERIMENTO del DNA SU MEMBRANA. Il trasferimento si realizza preparando un SANDWICH.
Innanzitutto, bisogna mettere un SUPPORTO all’interno di una VASCHETTA nella quale si mette il BUFFER DI TRASFERIMENTO.
Il BUFFER è SSC (citrato salino-sodio), si parte da uno STOCK 20x e nel caso del SOUTHERN BLOTTING si DILUISCE 1:2 quindi il TRANSFER BUFFER effettivo per il southern blotting è un 10x SSC.
Il LIVELLO del buffer rimane un pochino al di SOTTO del SUPPORTO utilizzato e su questo supporto viene messo un FOGLIO DI CARTA DA FILTRO che COPRE interamente il SUPPORTO e PESCA all’interno del BUFFER contenuto nella vaschetta.
3MM PAPER è un FOGLIO DI CARTA DA FILTRO di particolare SPESSORE indicato dalla sigla 3MM.
Le ESTREMITA’ del foglio di carta da filtro, pescando nel buffer, vengono BAGNATE dal BUFFER stesso che ENTRA nella CARTA per CAPILLARITA’.
Una volta che TUTTO il FOGLIO di carta da filtro è stato BAGNATO con il buffer, si posiziona SOPRA di questo il GEL che precedentemente è stato DENATURATO, NEUTRALIZZATO ed EQUILIBRATO in 2x SSC. Questo GEL viene poggiato sul FOGLIO di carta da filtro e SOPRA il gel viene messa la MEMBRANA per il TRASFERIMENTO. Sopra la membrana per il trasferimento si mette un’ELEVATA QUANTITA’ di FOGLI di carta, FAZZOLETTI DI CARTA (10-15 cm di altezza) sui quali si mette un PESO di circa 500g. La funzione dei FOGLI DI CARTA e del PESO che viene messo sopra è quella di far SALIRE per CAPILLARITA’ il BUFFER DI TRASFERIMENTO verso i FOGLI di carta che sono ASCIUTTI ossia la CARTA ASCIUTTA tende a RICHIAMARE verso di sé il BUFFER che passa attraverso il GEL e trasporta verso la MEMBRANA salendo verso l’ALTO il DNA.
Questo BUFFER è ad ELEVATA CONCENTRAZIONE SALINA e quindi il TRASFERIMENTO è per CAPILLARITA’ ossia il SALE si COMPLESSA con il DNA che è CARICO NEGATIVAMENTE e il LIQUIDO che viene RICHIAMATO verso l’ALTO da questi FOGLI di carta ASCIUTTI nello spostarsi TRASCINA con sé il DNA che quando raggiunge la MEMBRANA si BLOCCA, viene IMMOBILIZZATO sulla MEMBRANA stessa.
