Lezione 19: Protein Sorting E Citoscheletro

Question 1

I mitocondri sono in grado di sintetizzare le loro proteine?

Answer 1

Sì.
Queste sono 13 proteine molto idrofobiche che vengono sintetizzate a partire dal genoma mitocondriale (nella matrice) e che poi vengono localizzate sulla membrana mitocondriale interna

Question 2

Perchè il mitocondrio sintetizza a partire dal genoma mitocondriale 13 proteine fortemente idrofobiche?

Answer 2

Affinché una proteina entri nel mitocondrio deve essere in uno stato unfolded.

Le proteine idrofobiche unfolded sono molto pericolose perchè rischiano di formare aggregati, per questo preferito mantenere la sintesi di quelle poche proteine all’interno della matrice esattamente vicino a dove
verrano inserite; invece, tutte le altre proteine vengono importate.

Question 3

Dimmi 4 trasportatori che servono per traslocare le proteine prodotte nel citosol nei vari compartimenti mitocondriali

Answer 3

-TOM (Transporters of the Outer Membrane),
-SAM
-TIM (Transporters of the Inner Membrane),
-OXA

Question 4

Qual è la sequenza segnale delle proteine prodotte nel citosol che devono essere inserite nella matrice mitocondriale?

Answer 4

La presenza di un’alfa elica anfipatica (aa positivi+ aa idrofobici)

Question 5

La traslocazione delle proteine citosoliche nel mitocondrio avviene contemporaneamente o post la traduzione?

Answer 5

Post

Question 6

In che stato di folding si deve trovare una proteina affinchè essa venga traslocata nel mitocondrio?

Answer 6

Unfolded (per questo in generale, nel processo di traslocazione nel mitocondrio, si necessita sempre di ATP)

Question 7

Le proteine citosoliche unfolded che devono essere inserite nel mitocondrio possono permanere in questo stato?

Answer 7

No, perché tenderebbe ad aggregare, quindi la cellula utilizza delle chaperones (HSP70) che funzionano da HOLDASI e delle chaperones (HSP60) che fungono da FOLDASI

Question 8

Come avviene la traslocazione delle proteine citosoliche nella matrice mitocondriale?

Answer 8

1) chaperones HSP70 citosolica prende la proteina unfolded e la avvicina al traslocatore TOM (sulla membrana mitocondriale esterna) (viene usato ATP)

2)TOM si allinea al traslocatore TIM23 (sulla membrana mitocondriale interna)

3) la membrana mitocondriale esterna ed interna, vengono quasi a contatto l’una con l’altra in modo che il canale sulla membrana esterna sia esattamente di fronte al canale sulla membrana interna e si crei un unico canale attraverso il quale la proteina viene portata all’interno della matrice

4)la proteina unfolded arriva nella matrice e viene presa da HSP60 mitocondriale, che fa avvenire il folding della proteina e la sequenza segnale (ossia l’alfa elicxa anfipatica viene eliminata) (viene usato ATP)

Question 9

La traslocazione di una proteina citosolica nella matrice mitocondriale richiede ATP? Se si in che fasi?

Answer 9

Sì,

-viene usato ATP da HSP70 citosolica e da HSP60 mitocondriale

Question 10

Cosa vuol dire che un mitocondrio è depolarizzato?

Answer 10

Un mitocondrio depolarizzato è un mitocondrio che ha una catena respiratoria che non è funzionale e quindi non ha un gradiente protonico corretto

Question 11

Un mitocondrio depolarizzato può importare correttamente le proteine citosoliche? Perchè

Answer 11

No, perchè non viene prodotta abbastanza ATP da usare nel processo di traslocazione

Question 12

Come avviene l’inserimento delle proteine citosoliche nella membrana mitocondriale esterna? Fai 2 esempi di proteine

Answer 12

-sfruttano il complesso TOM40 + SAM+ chaperones (HSP70)
Es. proteina VDAC (struttura: B-barrels)
Es. il complesso TOM stesso

Question 13

Quali sono i 2 modi in cui avviene l’inserzione di proteine citosoliche sulla membrana mitocondriale interna?

Answer 13

1) abbiamo prima un’interazione con i complessi TOM, poi un passaggio al complesso TIM (sulla membrana
mitocondriale interna) che si apre lateralmente e lascia la proteina inserita in membrana interna).

2) abbiamo prima un’interazione con i complessi TOM, poi un passaggio al complesso TIM (sulla membrana
mitocondriale interna), poi la proteina viene presa da una HSP70 della matrice mitocondriale.
Infine la proteina viene reinserita nella membrana
mitocondriale interna utilizzando questo
traslocatore che si chiama OXA.

Question 14

Sì possono formare i ponti disolfuro nello spazio Inter membrana del mitocondrio?

Answer 14

Sì, infatti lo spazio Inter membrana del mitocondrio è un ambiente ossidante

Question 15

In che modo avviene la formazione dei ponti disolfuro nello spazio Inter membrana?

Answer 15

1)la proteina unfolded entra nello spazio Inter membrana tramite il complesso TOM

2)la proteina Mia40 catalizza la formazione dei ponti disolfuro (funziona come le ossidoriduttasi
de reticolo endoplasmatico):
*Mia40 sì red
*la proteina di ox

3) Mia40 viene ossidata da Erv1:
*Mia40 si ox
*Erv1 si red

Sì ripete il processo

Question 16

Dimmi
-cos’e la catalasi
-dove si trova

Answer 16

-enzima ossidativo (detossifica il perossido di idrogeno:
H2O2—>2 H2O)

-si torva all’interno del perossisomi

Question 17

Da dove arrivano le proteine che devono essere inserite
-sulla membrana
-nel lume
Del perossisoma?

Answer 17

-arrivano dal RE (la membrana del RE si gemma andando a formare una vescicola, in cui è inserita la proteina. La vescicola arriva al perossisoma e si fonde con la sua membrana ancorando la proteina ad essa)

-arrivano dal citosol perchè sono prodotte dai ribosomi liberi

Question 18

Come avviene la traslocazione delle proteine che devono essere inserite nel lume del perossisoma?

Answer 18

Ci sono 2 tipi di trasportatori (per 2 tipi di sequenza segnale):

-Peroxisomal signal trnsport sequence 1—> SKL (Ser, Lys, Leu) vengono trasportate all’interno del perossisoma dal traslocatore Pex14

-Peroxisomal signal trnsport sequence 2—> Arg, Lys,Leu, aa hanno un altro trasportatore

Question 19

Quando avviene l’import delle proteine nei perossisomi? In che stato di folding si trova la proteina?

Answer 19

Import post traduzionale, ma la proteina è già foldata !!!

Question 20

Nei perossisomi ci sono i chaperones?

Answer 20

No

Question 21

Cosa sono le lamine?

Answer 21

Sono delle proteine che costituiscono la lamina nucleare

Question 22

Dimmi 3 cose sulla struttura del poro nucleare

Answer 22

-È un complesso multi proteico di forma ottagonale costituito da 30 nucleoporine

-l’interno del poro nucleare non è vuoto ma è riempito dai loops idrofobici delle nucleoporine

-verso l’interno del poro nucleare ci sono delle estroflessioni delle nucleoporine che presentano ripetizioni di Phe e Gly (impediscono alle molecole troppo grandi di diffondere liberamente)

Question 23

Come avviene il trasporto tramite i pori nucleari di
-molecole piccoli
-molecole tra 4o-60kDa
-molecole >60kDa

Answer 23

• le molecole piccole (es. piccoli ioni, ATP, GTP)—-> trasporto passivo

-molecole fino a circa 40–60 kDa)—-> possono ancora passare lentamente, ma il flusso è già più limitato (trasporto passivo)

-molecole poltre i 60 kdalton fanno trasporto attivo perchè verso l’interno del poro nucleare ci sono delle estroflessioni delle nucleoporine che limitano il passaggio

Question 24

Quali sono le sequenze che fanno capire se una proteina deve essere importata o esportata dal nucleo?

Answer 24

-importata—-> Nuclear localization signals (NLS): sequenza di aa carichi positivamente (può essere una sequenza unica continua oppure possono
essere due regioni che si avvicinano una all’altra. Nel momento in cui la proteina si folda queste due parti
cariche positivamente si avvicinano l’una all’altra.)

-esportata—-> Nuclear export signals (NES)

Question 25

Cosa succede se muto un aa della nuclearlocation signal?

Answer 25

Se muto un solo amminoacido la proteina non viene inserita nel nucleo, come se non avesse la nuclear localization signals.

Question 26

Come fa una proteina con la nuclear localization signals ad entrare nel nucleo

Answer 26

1)la proteina nel citosol espone la Nuclear localization signals che viene riconosciuta da 2 proteine: importina A e importina B 2) le importine legano la proteina e la fanno interagire con i loop idrofobici delle nucleoproteine (all’interno del poro nucleare), così il complesso importine-proteina “salta” da un loop ad un altro fino ad entrare nel nucleo 3)un volta nel nucleo le importine rilasciano la proteina grazie alla proteina regolatrice Ran : Ran (legata al GTP) fa rilasciare la proteina alle importine ed esporne una sua nuclear export signals. Così viene portano all’esterno della cellula assieme alle importine 4)Ran idrolizza GDP e rilascia le importine rilasciate nel citosol e riprende il ciclo

Question 27

Come funziona la proteina regolatrice Ran per il trasporto delle proteine nel nucleo?

Answer 27

-nel nucleo—> legata a GTP (perchè c’è una GEF che fa uscire il GDP e fa legare GTP a Ran) -nel citosol—-> legata a GDP (perchè c’è una GAP che stimola l’attività GTPasica di Ran)

Question 28

Che tipo di proteina regolatrice è Ran (per il trasporto delle proteine nel nucleo)?

Answer 28

Una piccola GTPasi

Question 29

Come posso marcare una proteina nella cellula?

Answer 29

Uso la GFP protein—-> una proteina che è espressa normalmente in una medusa e che ha la capacità di essere fluorescente

Question 30

Come fa una proteina con la nuclear export signals ad uscire dal nucleo

Answer 30

1)la proteina nel nucleo espone la Nuclear export signal che viene riconosciuta da una esportina e da Ran legato a GTP 2)il complesso esce dal nucleo e Ran idrolizza GTP: così cambia conformazione e rilascia l’esportina e la proteina nucleare 3)l’esportina ritorna nel nucleo

Question 31

Dimmi 3 funzioni del citoscheletro

Answer 31

-determinano la forma della cellula -determinano la posizione degli organuli della cellula -serve per il movimento sia delle cellule sia all’interno della cellula

Question 32

Quali sono i 3 tipi di strutture cito scheletriche?

Answer 32

Microfilamenti, microtubuli e filamenti intermedi

Question 33

Dimmi 4 cose sui microtubuli del citoscheletro

Answer 33

-cilindri costituiti da dimeri di tubulina α e β che si associano a formare un proto filamento -13 proto filamenti formano un microtubulo -il microtubulo non è simmetrico—-> l’estremità con l’α-tubulina è detta “estremità -“, l’estremità con la b-tubulina è detta “estremità +” -sono molto rigidi

Question 34

Come si chiama il processo di associazione della tubuli a per formare i microtubuli?

Answer 34

Polimerizzazione/ nucleazione

Question 35

Come avviene il processo di nucleazione dei microtubuli

Answer 35

1)fase di lag—-> dimeri di tubulina si attaccano e si staccano ma il dimero non è stabile; ad un certo punto, per puro caso, si forma una struttura un po’ più grossa chiamata oligomero (cioè una struttura fatta da poche molecole). L’oligomero è stabile e a questo punto funziona da nucleo per la polimerizzazione -Nel momento in cui inizia la polimerizzazione, la polimerizzazione procede molto rapidamente fino a raggiungere una fase di equilibrio (ci sono dimeri di tubulina che si aggiungono alla struttura e dimneri che si staccano, quindi il microtubulo è una struttura DINAMICA!)

Question 36

Che cosa fa sì che il microtubulo sia in realtà una struttura dinamica?

Answer 36

Il fatto che la tubulina è capace di legare e idrolizzare il GTP. Se non ci fosse il GTP, una volta che si è formato il polimero resterebbe sempre polimero; invece, con il fatto che la tubulina lega il GTP e, una volta che si è inserita nel microtubulo, idrolizza il GTP a GDP, si crea un cambiamento conformazionale nella tubulina che fa sì che la struttura del microtubulo sia più debole e quindi che il microtubulo possa, in determinate condizioni, essere disassemblato dalla cellula

Question 37

Quale tra le due estremità del microtubulo -È più stabile -tende a depolarizzarsi?

Answer 37

-stabile—-> estremità + / B-tubulina(quindi tende a polimerizzarsi) -instabile—-> estremità -alfa-tubulina (quindi tende a depolarizzarsi)

Question 38

Che cos’è l’emivita di una sostanza?

Answer 38

È il tempo necessario affinchè metà di quella sostanza decada.

Question 39

Cosa succede ad un filamento di tubulina dopo che la struttura del microtubulo decade?

Answer 39

Viene inserita in un nuovo microtubulo grazie alla GEF che ricarica la tubulina di GTP

Question 40

Cos’è il treadmilling?

Answer 40

Meccanismo attraverso il quale il microtubulo presenta un equilibrio dinamico, quindi è una struttura dinamica (quando è in equilibrio continua ad avere inserzioni di nuove molecole all’estremità + e perdita di molecole all’estremità -. )

Question 41

Come sono organizzati i microtubuli nella cellula?

Answer 41

-si diramano a stella a partire dal microtubule organizing centre o centrosoma. In particolare i microtubuli partono dal centrosoma con la loro estremità – al centrosoma e la loro estremità + verso la periferia della cellula

Question 42

Che cos’è il microtubule organizing centre?

Answer 42

Un organulo cellulare membraneless da cui si diramano a stella tutti i microtubuli

Question 43

Da cosa sono organizzati i centri oli?

Answer 43

Triplette di microtubuli

Question 44

Da cosa sono costituiti i microfilamenti?

Answer 44

-polimeri di actina (si riconosce sempre un’estremità + e un’estremità -)

Question 45

Come viene inserita l’actina nei microfilamenti del citoscheletro?

Answer 45

L’actina per essere inserita in un polimero deve essere legata ad ATP; una volta che è inserita idrolizza ATP ad ADP e nel momento in cui il polimero depolimerizza verrà lasciata actina collegata ad ADP

Question 46

Cos’è il protein sorting?

Answer 46

Il protein sorting (in italiano: smistamento proteico) è il processo attraverso cui le proteine appena sintetizzate vengono indirizzate verso la loro destinazione finale all’interno o all’esterno della cellula.