Lezione 5:replicazione DNA

Question 1

Qual è la differenza tra cellule somatiche e cellule germinali?

Answer 1

Cellule somatiche—-> organizzano struttura organismo e non trasmettono niente alla prole. Devono essere protette da un’alta frequenza di mutazioni per mantenere organizzata la struttura del corpo

Cellule germinali —-> trasmettono l’informazione genetica del genitore alla prole. Devono essere prodotte da un’alta frequenza di mutazioni per mantenere la specie.

Question 2

Il cancro si è originata l’eccessiva proliferazione delle cellule somatiche o germinali

Answer 2

Somatiche

Question 3

Cos’è una mutazione?

Answer 3

cambiamento permanente nel DNA che può portare alla morte dell’organismo se avviene
in una sequenza vitale

Question 4

Qual è la probabilità di mutazione
-nell’uomo
-nell’E.Coli

Answer 4

Question 5

Dimmi due esempi di errori durante la sintesi di DNA

Answer 5

1) tra le basi azotate si forma un numero sbagliato di legami idrogeno (cambia la geometria della doppia elica)
2) le forme tautomeriche rare delle basi azotate si possono appaiare con basi sbagliate (es. La forma automatica rara della C si appaia con A invece che con G)

Question 6

Perché le DNA polimerasi presentano meccanismi di autocorrezione e invece le RNA polimerasi no?

Answer 6

-le DNApol—-> non possono fare la sintesi de novo del nuovo filamento di DNA perché necessitano di Primers con l’estremità 3’-OH perfettamente appaiata

-le RNApol—-> possono fare la sintesi de novo del nuovo filamento di RNA (quindi no primers).

Question 7

Cosa succede al nuovo filamento di RNA se è stato commesso un errore durante la sua sintesi?

Answer 7

Ha vita breve nella cellula (quindi l’errore non viene corretto, invece nel DNA l’errore viene corretto)

Question 8

Qual è la frequenza di commettere errori durante la sintesi dell’RNA da parte dell’RNA polimerasi?

Answer 8

1 errore ogni 10^4 nucleotidi (frequenza più alta rispetto a quella del DNA!!!!)

Question 9

Perchè soltanto la replicazione nella direzione 5’-3’ permette una correzione efficiente degli errori?

Answer 9

Perchè se ci fosse una DNA polimerasi che aggiunge deossiribonucleosidi trifosfato nella direzione 3 -5 , l’estre-
mità 5 della catena in crescita, e non il mononucleotide in arrivo, porterebbe il trifosfato attivatore necessario per il legame covalente.
In questo caso gli errori di polimerizzazione non potrebbero essere semplicemente idrolizzati, perché l’estremità 5’ nuda terminerebbe immediatamente la sintesi del DNA (perché non ha il fosfato necessario per creare il legame fosco stereo con un altro nucleotide)

Question 10

Qual è la differenza tra il filamento leader e quello ritardato?

Answer 10

-filamento leader—> sintesi continua (ha come stampo il filamento di DNA vecchio 5’->3’)

-filamento ritardato—->sintetizzato in maniera discontinua (grazie ai frammenti di Okazaki) (ha come stampo il filamento 3’->5’)

Question 11

Di quanti primers necessita la DNASpol per la sintesi del filamento
-leader
-ritardato?

Answer 11

-filamento leader—-> 1 solo
-filamento ritardato—-> tanti primers quanti sono i frammenti di okazaki

Question 12

In che modo un filamento di DNA può crescere in direzione 3 -5 ?

Answer 12

Grazie ai frammenti di okazaki (sono sintetizzati in direzione 5-3’ e poi vengono uniti dando origine al filamento ritardato)

Question 13

Perché il filamento ritardato man mano che viene sintetizzato si ripiega all’indietro?

Answer 13

-per aumentare l’efficienza della polimerizzazione
-per facilitare il caricamento della pinza della DNApolimerasi ogni volta che viene sintetizzato un frammento di Okazaki:
il caricatore della pinza e la polimerasi del filamento ritardato sono tenuti in posizione come parte della macchina proteica anche quando si staccano dal DNA stampo.

Question 14

Cosa succede nell’uomo se il sistema di mismatch repair non funziona?

Answer 14

Question 15

In che modo viene regolata la replicazione del DNA negli eucarioti per fare in modo che un tratto di DNA venga duplicato una sola volta dal momento che ci sono più ORC?

Answer 15

Si forma un complesso pre replicativo (DNA ELICASI + ORC) che viene attivato tramite la fosforilazione e fa in modo che un ORC si attivi una sola volta durante un ciclo cellulare

Question 16

Dimmi 3 cose sulla DNA pol

Answer 16

-attacca inucleosidi 3P liberi all’estremità 3’ del filamento di nuova sintesi

-necessita dei primers per iniziare la sintesi

-ha la forma di una mano

Question 17

Qual è la direzione della sintesi del DNA?

Answer 17

5’—->3’

Question 18

Qual è il ruolo della DNA topoisomerasi?

Answer 18

-è una nucleasi (rompe reversibilmente i legami fosfodiesterici) che previene la formazione di super avvolgimenti positivi (dopo che l’elicasi denatura la doppia elica) che rallenterebbero la sintesi del DNA.
Affinché il DNA resti rilassato, i superavvolgimenti
introdotti dall’azione delle DNA elicasi vengono rimossi dalle Topoisomerasi. Questi enzimi tagliano uno o entrambi i filamenti del DNA facendoli passare attraverso la rottura. Fa passare “sotto” il
filamento del DNA creando il superavvolgimento negativo che è quello
permissivo per la replicazione del DNA.

Question 19

Cosa succede quando la DNApol è nella conformazione
-mano aperta
-mano chiusa

Answer 19

-mano aperta—->il sito attivo/ polimerizzazione (dita) legano il nucleoside 3P

-mano chiusa—-> il nucleoside 3P viene legato covalentemente al filamento di nuova sintesi (si stacca il PPi e si forma il legame fosfodiesterico con il nucleotide precedente)

Question 20

Quanti tipi di topoisomerasi ci sono?

Answer 20

-topoisomerasi I—-> produce una rottura (nick) temporanea ad un singolo filamento di DNA

-topoisomerasi II—-> produce una rottura (nick) temporanea a doppio filamento usando ATP

Question 21

Cos’è la PCNA?

Answer 21

È la pinza scorrevole degli eucarioti

Question 22

Dimmi 2 cose sulla pinza scorrevole della DNA pol

Answer 22

-Serve per tenere la DNApol agganciata al filamento stampo fin quando non incontra una regione di DNA a doppia elica

-il caricatore della pinza usa l’iodrolisi di ATP per legare la pinza attorno al DNA

Question 23

Perchè la forcella di replicazione è asimmetrica?

Answer 23

Perchè la sintesi del filamento Leading è più veloce di quella del filamento ritardato

Question 24

Dimmi due cose sulle origini di replicazione

Answer 24

-sono regioni ricche di AT (hanno 2 legami a H) da cui ha inizio la replicazione

-attirano proteine iniziatrici che rompono i legami a H tra le BA

Question 25

Qual è la differenza tra OriC e ORC

Answer 25

-OriC—-> sequenza del DNA da cui parte le replicazione -ORC—-> complesso di proteine iniziatrici reclutate dalle origini di replicazione

Question 26

Dimmi 4 cose sui primers

Answer 26

-sono filamenti di RNA che servono alla DNA polimerasi per la sintesi del nuovo filamento -si appaiano all’emielica del vecchio DNA (filamenti ibridi DNA-RNA) -vengono sintetizzati dalla DNA primasi -vengono eliminati da RNAsi (ribonucleasi H)

Question 27

Qual è il compito della DNA LIGASI?

Answer 27

Unisce tra di loro i frammenti di Okazaki

Question 28

Come fa la DNA ligasi a svolgere il suo compito?

Answer 28

Usa idrolisi di ATP: Lega l’estremità 3’ del nuovo frammento all’estremità 5’ del vecchio frammento

Question 29

Dimmi 3 cose sui frammenti di Okazaki?

Answer 29

-servono per la sintesi discontinua del filamento ritardato -vengono sintetizzati in direzione 5’->3’ e poi vengono uniti dalla DNA ligasi -negli eucarioti sono lunghi 100-200 nucleotidi, nei batteri sono lunghi 1000-2000 nucleotidi

Question 30

Dimmi 3 cose sulla DNA elicasi

Answer 30

-apre la doppia elica del DNA -si muove in direzione 5’->3’ -usa idrolisi di ATP

Question 31

Come fanno le DNA elicasi ad aprire la doppia lega del DNA?

Answer 31

Scorrono su un singolo filamento di DNA, poi quando incontrano una regione a doppia elica, continuano a scorrere sul loro filamento (così svolgono la doppia elica

Question 32

Dimmi 3 cose su SSBP

Answer 32

-legano il DNA a singolo filamento -aiutano la DNA elicasi a mantenere svolta la doppia elica del DNA -si legano al singolo filamento di DNA in maniera cooperativa e senza coprire le basi (il legame cooperativo raddrizza il singolo filamento di DNA per evitare la formazione di “eliche a forcina”)

Question 33

Cos’è la bolla di replicazione?

Answer 33

È l’unione di due forcelle di replicazione (si muove verso l’esterno

Question 34

Dimmi le fasi della replicazione del DNA

Answer 34

Question 35

In quale fase del ciclo cellulare -aumenta -diminuisce l’attività delle S-Cdk ?

Answer 35

-diminuisce in fase G1 -aumenta in fase S

Question 36

Cosa sono le S-Cdk?

Answer 36

Proteine che fosforilano gli ORC per avviare la sintesi del DNA

Question 37

Quali sono i 2 meccanismi di proof reading della DNA pol?

Answer 37

Question 38

Cos’è il Mismatch repair?

Answer 38

Meccanismo di riparazione del DNA che corregge il filamento di nuova sintesi (se è stata inseguiva una base sbagliata la corregge)

Question 39

Qual è il problema di replicazione dell’estremità del cromosoma?

Answer 39

Questo problema emerge perché, durante la replicazione del DNA, il filamento ritardato viene sintetizzato in modo discontinuo, formando brevi frammenti chiamati frammenti di Okazaki. Ogni frammento ha bisogno di un primer di RNA primer per essere sintetizzato, ma quando la forcella di replicazione arriva alla fine di un cromosoma, non c’è spazio per un primer di RNA all’estremità del filamento, il che impedisce alla polimerasi di DNA di completare la sintesi. Di conseguenza, senza un meccanismo che affronta questo problema, ogni volta che una cellula si divide, parte del DNA nelle estremità dei cromosomi verrebbe perso.

Question 40

Come si fa ad evitare la perdita dei geni contenuti all’estremità del cromosoma?

Answer 40

-nei batteri—-> cromosomi circolari (quindi non ci sono estremità) -negli eucarioti—-> telomeri

Question 41

Cosa sono i telomeri?

Answer 41

-sono sequenze ripetitive di basi poste all’estremità del cromosoma -ad ogni replicazione cellulare si accorciano sempre di più senza creare danni (perché la sequenza ripetitiva e quindi il pazzo che perdo è uguale a quello che rimane). Però, prima o poi, il termometro si accorcia troppo e questo viene ripristinato dalla telomerasi

Question 42

Cos’è la telomerasi?

Answer 42

-Enzima che allunga il telomero (è una trascrittasi inversa: utilizza RNA come stampo per allungare il DNA) (Ricorda: l’estremità 5’ del telomeri sarà sempre più corta della 3’ perchè viene comunque eliminato il primer usato per la sintesi del filamento leading

Question 43

Qual è la struttura della telomerasi?

Answer 43

Complesso diRNA+ proteine -RNA—-> serve da stampo per la sintesi della sequenza telomerica di DNA (in blu nella foto) -proteine—-> hanno un dominio di trascrittasi inversa per permettere la sintesi di DNA a partire da RNA (in verde nella foto)

Question 44

Come avviene l’allungamento dei telomeri?

Answer 44

Question 45

Quali sono i sitestemi di riparazione del DNA (DNA damage responde)?

Answer 45

-attività di proofreading della polimerasi -mismatch repair

Question 46

Dimmi 3 funzioni dei telòomeri

Answer 46

-prevengono la perdita di informazioni durante la replicazione del DNA -Agiscono con il contatore delle divisioni cellulari—-> serve per prevenire la proliferazione di cellule danneggiate (tumori) -Agiscono come contatore della senescenza cellulare—-> smette di dividersi

Question 47

Cosa vuol dire che una cellula produce -tante telomerasi -poche telomerasi Fai esempi di cellule

Answer 47

-tante telomerasi—-> si replica tanto (es. cellule staminali) -poche telomerasi—-> si replicano di meno (es. cellule somatiche, fifroblasti)

Question 48

Quali sono le fasi del meccanismo di protezione dei telomeri da -danni -eventuali riparazioni di DNA?

Answer 48

Question 49

Perchè i telomeri devo essere protetti dai meccanismi di riparazione del DNA?

Answer 49

Perchè le estremità dei telomeri, dal momento che sono una più lunga e una più corta, vengono riconosciute come un cromosoma rotto da riparare

Question 50

Dimmi 2 cose sulla discheratosi congenita

Answer 50

-patologia genetica in cui i telomeri si accorciano prematuramente e muoiono -gli individui affetti hanno il gene sano il gene mutato per l’RNA stampo della telomerasi

Question 51

Ci sono più telomerasi nelle cellule -germinali -somatiche? Perchè?

Answer 51

Question 52

Cos’è la senescenza cellulare?

Answer 52

Processo in cui le cellule smettono di replicarsi, ma non muoiono

Question 53

Quali sono le 3 ipotesi su come potesse essere la replicazione del DNA?

Answer 53

Semiconservativa (Meselson e Stahl): la molecola era formata da un filamento originale e uno neosintetizzato • Conservativa: la molecola era formata o da DNA parentale o da DNA neosintetizzato • Replicazione dispersiva (Delbruck): la molecola era formata da pezzi di DNA parentale e neosintetizzato mischiato

Question 54

In cosa consiste l’esperimento di Meselson e Stahl

Answer 54

1) Hanno estratto il DNA dai batteri cresciuti nel terreno con 15N e lo hanno posto in soluzioni contenenti cloruro di cesio ad alta concentrazione (elevata densità) in modo da poter separare il gradiente di densità del DNA 2)Hanno sottoposto le provette a centrifugazione e, grazie all’utilizzo di un colorante fluorescente, videro che nella parte bassa della provetta si era formata una banda di DNA contenente 15N (densità= 1,80) 3) I batteri fatti crescere precedentemente con 15N vengono poi messi in una coltura con 14N. Li fanno crescere per 20min e poi estraggono il DNA, lo centrifugano e, grazie al colorante fluorescente aggiunto, vedono che si forma una banda intermedia. Si è formato un DNA ibrido (densità=1,72) 4)I batteri vennero fatti ancora riprodurre per 20min, poi il DNA estratto e centrifugato. Si vide una banda posta in alto, si era ottenuto un DNA leggero (densità=1,65) e una intermedia

Question 55

Dimmi 4 differenze nella replicazione del DNA tra eucarioti e batteri

Answer 55

1)SSBP *batteri—> c’è 1 sola SSBP *eucarioti—->una SSBP è formata da 3 subunità 2)DNA polimerasi *batteri—-> è più veloce, 3 DNApol (I, II: riparazione DNA, III replicazione) *eucarioti—->è più lenta, 4 DNA pol (vedi foto) 3)Nucleosomi *batteri—-> no nucleosomi (quindi DNA pol è più veloce perchè non è rallentata dai nucleosomi) *eucarioti—-> si nucleosomi (quindi DNApol è più lenta) 4) origine di replicazione *batteri—-> 1 OriC e 2 forcelle di replicazione che si uniscono (processo veloce) *eucarioti—-> 30.000-50.000 origini di replicazione, ognuna delle quali da origine ad una forcella (processo lento)

Question 56

Chi si replica prima tra -etero cromatina -eucromatina In fase S?

Answer 56

-etero cromatina—-> si duplica più tardi in fase S -eucromatina—-> si replica prima rispetto all’eterocromatina perchè è più aperta

Question 57

Quale enzima denatura la doppia elica del dna?

Answer 57

DNA elicasi! (La topoisomerasi previene il riavvolgimento della doppia elica)

Question 58

Qual è la funzione dell’RNAsiH?

Answer 58

Question 59

Fammi 2 esempi di cellule che esprimono la telomerasi

Answer 59

-cellule germinali—-> (non somatiche!!!) infatti le somatiche vanno in senescenza e di conseguenza il loro telomeri ad ogni divisione vengono accorciati. -cellule tumorali—-> le telomerasi fanno in modo che i telomeri non si accorcino (così la cellula non va in senescenza e continua a proliferare)