Lezione 11: lo Studio Delle Proteine E Microscopia Flashcards
(22 cards)
Attraverso cosa avviene lo studio delle proteine?
Sfruttando gli anticorpi
Quando vengono prodotti gli anticorpi?
Vengono prodotti in risposta ad una proteina estranea all’organismo (virus o un batterio) che stimola il nostro sistema immunitario.
Quali sono i 2 tipi di anticorpi?
-monoclonali—-> derivano da un solo tipo di cellula immunitaria e si legano ad un solo antigene
-policlonali—-> derivano da più tipi di cellule immunitarie e si legano a più antigeni
Cos’è il Western Blot?
Tecnica utilizzata per individuare specifiche proteine in un campione complesso (es. serve per individuare proteine associate a malattie).
In questo caso la cellula muore necessariamente per permettere di estrarre le proteine
Quali sono le fasi del western blot?
1.PREPARAZIONE DEL CAMPIONE: Le cellule vengono frantumate per estrarre le proteine. Questo può essere fatto utilizzando detergenti che sciolgono le membrane cellulari, come il sodio dodecil solfato (SDS), che denatura le proteine e le carica negativamente.
2. SEPARAZIONE PROTEINE (SDS-PAGE): Le proteine vengono separate su un gel di poliacrilammide in base al loro peso molecolare (elettroforesi). L’SDS conferisce alle proteine una carica negativa uniforme, permettendo la loro separazione in base alla massa durante l’elettroforesi. 3. TRASFERIMENTO SU MEMBRANA(blotting): Le proteine separate vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa 4. BLOCCAGGIO : La membrana viene trattata con una soluzione contenente proteine non specifiche (come albumina bovina sierica) per prevenire legami aspecifici durante la fase successiva. 5. RILEVAZIONE (DETECTION): *Anticorpo primario: la proteina viene incubata con un anticorpo specifico per la proteina di interesse.
*Anticorpo secondario: Un anticorpo secondario, coniugato a un enzima viene utilizzato per legarsi all’anticorpo primario.
*Rivelazione: L’enzima coniugato catalizza una reazione che produce un segnale rilevabile, come una reazione colorimetrica, chemiluminescente o fluorescente. Così si riesce a capire di che proteina si tratta
Dimmi 2 applicazioni del western blot
-individuare proteine che causano patologie
-valutare l’espressione proteica
Cos’è la flow cytometry?
Tecnica per individuare delle specifiche proteine ma, ad differenza del western blot, in questo caso, la cellula non deve necessariamente morire (infatti se la proteina è sulla superficie della cellula, l’anticorpo lo posso usare senza dover lisare la cellula)
Cos’è la co- immunoprecipitazione?
La co-immunoprecipitazione (Co-IP) è una tecnica utilizzata per studiare se due o più proteine interagiscono tra di loro
Come funziona la co immunoprecipitazione?
un anticorpo specifico viene utilizzato per catturare una proteina target (nota come “esca” o “bait”) presente in un campione.
Se altre proteine (“prede”) sono legate fisicamente alla proteina esca, esse verranno co-precipitati insieme all’esca.
(Così capisco se interagiscono tra loro)
Cos’è la spettrometria di massa?
La spettrometria di massa è una tecnica analitica avanzata utilizzata per identificare e quantificare proteine e metaboliti in campioni biologici complessi, anche senza conoscere la loro sequenza o struttura in anticipo.
È fondamentale in proteomica e metabolomica per esplorare l’intero spettro proteico e metabolico di una cellula o di un tessuto.
Cos’è e come funziona lo spettrometro di massa
Lo spettrometro di massa è uno strumento che riesce a calcolare la massa delle singole molecole (es. proteine) in formato di ione, cioè dopo che hanno ricevuto una carica elettrica.
Gli ioni carichi poi entrano nello spettrometro, fanno vari giri accelerati nel vuoto da campi elettrici e magnetici e si muovono con
dinamiche precise in base al loro rapporto (m/z cioè massa-carica); infatti in base ai loro percorsi lo spettrometro è calibrato per discriminare e identificare la presenza di ioni con diversa di massa.
Queste informazioni a volte sono sufficienti per determinare l’identità di un campione
Quali sono le 4 fasi della spettrometria di massa?
-ionizzazione—-> i pezzi di proteina vengono ionizzati
-separatore/analizzatore di masse—-> i pezzi di proteina vengono inseriti nei mass analizer, cioè delle camere con separatori e analizzatori di massa, in cui le particelle cariche vengono fatte correre. In base al loro percorso, orbita, tempo impiegato, lo spettrometro riesce a calcolare la loro massa.
-rilevatore—-> Alla fine dei mass analizer c’è un rilevatore che rileva le masse calcolate
-analisi dei dati
Qual è lo scopo della microscopia?
Capire dove è localizzata una proteina nella cellula
Quali sono i due principali tipi di microscopio?
-ottico—-> microscopio che sfrutta i fotoni della luce
*Con questo tipo di microscopio si riescono a vedere al massimo le creste mitocondriali, all’interno dei
mitocondri. Non è possibile invece vedere i ribosomi oppure le proteine. I microscopi ottici più comuni in
laboratorio riescono a distinguere solo i nuclei e gli altri compartimenti cellulari.
*campione: cellulòe vive
*RISOLUZIONE 200nm (perchè i fotoni hanno una lunghezza d’onda elevata e per questo la loro risoluzione è bassa)
-elettronico (tem)—->microscopio che sfrutta gli elettroni che bombardano il campione e lo eccitano (si usano tecniche di contrasto)
*si riescono a vedere: nuclei, eterocromatina, organelli cellulari
*campione: solo cellule morte
*RISOLUZIONE 0,1nm (perchè gli elettroni hanno una lunghezza d’onda minore dei fotoni, per questo la risoluzione è maggiore)
Quali sono le 3 tecniche di contrasto del tem?
-colorazioni—->
*si fissa il campione tramite formaldeide (tipo imbalsamazione)
*si colora il campione
-immunofluorescenza—-> Tecnica che sfrutta anticorpi coniugati con fluorofori.
*Anticorpo primario: si lega alla proteina d’interesse.
*Anticorpo secondario: si lega al primario ed è coniugato con un fluoroforo. Così si riesce a visualizzare specifiche proteine nel campione.
-immunogold—->
*Anticorpo primario: si lega alla proteina d’interesse.
*Anticorpo secondario: si lega al primario ed è coniugato con particelle d’oro che appaiono come puntini neri al tem. Così si riesce a visualizzare specifiche proteine nel campione.
Qual è la colorazione più utilizzata per colorare i campioni?
Ematossinina -eosina
-ematossinina—> colora i nuclei di blu (attirata dalle cariche negative del DNA)
-eosina—> colodìra di rosa il citoplasma e la matrice extracellulare
Su cosa si basa il principio della fluorescenza
Alcune molecole (fluorofori/fluorocromi) possono assorbire luce ad alta energia (lunghezza d’onda più corta).
• Gli elettroni dei fluorofori saltano a un livello energetico superiore.
• Dopo un brevissimo tempo, gli elettroni tornano al livello energetico iniziale, emettendo luce (fluorescenza) a energia più bassa (lunghezza d’onda più lunga)
Qual è la relazione tra lunghezza d’onda e energia?
-Lunghezza d’onda corta = energia alta (es. blu, UV).
-Lunghezza d’onda lunga = energia bassa (es. rosso, infrarosso).
Oltre agli anticorpi cosa possono rilevare le sonde fluorescenti?
Calcio
Specie reattive dell’ossigeno (ROS)
Qual è la differenza tra anticorpo
Primario
Secondario
-primario.—> si lega direttamente alla sua proteina bersaglio (proteina che antagonista)
-secondario—-> si lega all’anticorpo primario (è più generico) ed è a sua volta legato ad un enzima/altra molecola che funge da matrcatore
Quali sono le 4 tecniche per determinare la struttura di una proteina?
1) cristallografia a raggi X—-> solo con proteine ordinate
2)NMR (risonanza magnetica nucleare)—-> anche con proteine disordinate
3) cryo-em—-> si deve congelare molto rapidamente la proteina e
il campione da cristallizzare in modo tale che non perda la sua struttura
4)AlphaFold—-> programma che permette di vedere in silico (solo con i dati) la struttura terziaria di una proteina sulla base della sua sequenza aa
Quale tecnica posso usare per vedere la localizzazione di una proteina?
Immunofluorescenza
(Western blotting utilizzabile solo se prima centrifugo e ottengo i vari organelli separati. Devo
compiere un frazionamento cellulare)
