Lezione 17: Manipolazione Delle Colture Cellulari Flashcards
(27 cards)
Cos’è la coltura cellulare?
è un’applicazione che ci permette di crescere delle cellule,
provenienti da un organismo vivente, in ambienti controllati e tenerle così come le abbiamo
prelevate per un determinato tempo (esperimento in vitro)
A cosa serve la penicillina nelle colture cellulari?
Ad evitare la contaminazione delle cellule da parte di embrioni
Cosa sono le HeLa cell Line?
Sono le prime cellule di cancro messe in coltura (derivano dalla cervice uterina della paziente Henrietta Lack)
RICORDA: le cellule tumorali sono particolari perché non
vanno contro senescenza, ossia non muoiono
Come vennero sfruttate le HeLa cell Line?
-produzione virus poliomielite
-furono utilizzate per capire i benefici dell’HbS contro la leucemia
-furono usate per capire che il papillomavirus può causare il cancro
-si capì il virus dell’HIV non è in grado di infettare le HeLa
Cosa sono i microplasmi?
sono batteri senza
parete cellulare che infettano le cellule e causano cambiamenti
metabolici
Dimmi 3 strumenti utili per la crescita delle colture cellulari
-Multiwell
-piastre petri (piastra rotonda)
-fiasche
Dimmi 2 modi per contare le cellule in vitro
-emocitrometro o camera di Burker
-cell counter
Come devono essere la
-temperatura
-osmolarità
-umidità
Livelli di CO2
-ph
Quando si coltivano le cellule in vitro?
- Temperatura 37°
- Osmolarità (numero totale di molecole e ioni in una soluzione, range 280–320 Osm/l)
- Umidità pari al 98%
- Livelli di CO2 (5-10%)
- pH (7.0-7.4)
Cosa bisogna aggiungere al terreno di coltura?
- Ioni, per mantenere il bilancio osmotico;
- Zuccheri (glucosio) come fonte di energia;
- Amminoacidi, per la formazione di proteine; L-glutammina aa non essenziale
aggiunto come supplemento - Vitamine, cofattori enzimatici, ormoni, fattori di crescita 5.
- Antibiotici per mantenere l’ambiente sterile
Cosa indicano le varie colorazioni del colorante rosso fenolo?
- Colore rosa /fucsia: indica un pH intorno a 8.4, quindi non utilizzabile (indica assenza
di O2) - Colore giallo: indica un pH intorno a 6.8, quindi non utilizzabile perché troppo basso
(coltura satura = le culture hanno consumato i nutrienti) - Colore rosso: pH giusto pari a 7.5
Quali sono le 3 fasi del ciclo vitale di una coltura cellulare?
-fase I o FASE DI LATENZA O FASE LAG—->le cellule si adattano alle condizioni in vitro (quindi crescono molto lentamente)
-Fase II o FASE ESPONRENZIALE—-> le cellule si sono adattate alle condizioni in vitro e crescono molto velocemente
-Fase III o FASE DI SENESCENZA SENESCENZA o FASE STAZIONARIA —-> solo per le colture primarie!!! (Infatti per le cellule tumorali, che non vanno in senescenza, la fase esponenziale dura sempre)
Qual è la differenza tra colture primarie e colture immortalizzate?
-colture primarie—->
*vanno in senescenza
* derivano da tessuti umani o animali
* vantaggio: mantengono con maggiore probabilità le caratteristiche delle cellule in vivo
*svantaggio: le cellule sono continuamente da prelevare sia
dagli animali che dalle persone, perché dopo un certo numero di volte vanno in senescenza
-colture immortalizzate (es. HeLa cell Line)—->
*non vanno in senescenza
* derivano spesso da tessuti tumorali di pazienti
*svantaggio:proliferano velocemente (per questo non mantengono le stesse caratteristiche delle cellule in vivo)
*vantaghgio:disponibili commercialmente
Cos’è il limite di Hayflick?
impossibilità di duplicare le cellule oltre un certo limite a causa della lunghezza dei telomeri che vengono consumati (portano alla senescenza cellulare)
Dimmi le differenze tra cellule normali e cellule tumorali per quanto riguarda:
-capacità replicativa
-nuclei
-divisioni e disposizione
-forma
Quali sono i 2 modi in cui possono crescere le cellule?
1) In aderenza—->ossia attaccate al fondo della piastre a formare un monostrato
(Es. cellule di tessuti solidi: polmone, rene, muscolo, epitelio)
2) in sospensione—-> ossia fluttuano nella piastra (es. cellule di origine ematopoietica: limfoblasti)
Dimmi 2 sistemi di studio che rientrano nella coltura 3D
Sferoidi e Organoidi
Dimmi 3 cose sugli sferoidi
-sono colture cellulari 3D che derivano da un solo tipo cellulare (quindi simulano un ambiente tridimensionale più specifico delle colture 2D ma non mimano un organo)
-crescono in aderenza
-servono per studiare le interazioni tra le cellule tumorali e le cellule del sistema immunitario
Dimmi 3 cose sugli organoidi
-strutture 3D che derivano da più tipi cellulari (quindi è come se fossero dei piccoli tessuti o organi in miniatura)
-derivano dalle cellule staminali (pluripotenti o adulte) che poi si differenziano nei vari tipi di cellule
-sono utili nella ricerca oncologia, farmacologia, biologia dello sviluppo (studio embrioni)
Quali sono i 4 tipi di cellule staminali?
-totipotenti—->cellule al primo stadio di sviluppo (cellula uovo fecondata da spermatozoo).
Possono dare origine all’intero organismo
-pluripotenti (PSCs)—->cellule della blastocisti.
Possono originare tutti i tipi cellulari (ectoderma, mesoderma e endoderma)
-multipotenti—-> Possono differenziarsi in diversi tipi cellulari, ma solo all’interno di una famiglia di cellule specifica.
(Esempio:
Le cellule staminali ematopoietiche (del midollo osseo) sono multipotenti perché possono dare origine a tutti i tipi di cellule del sangue, ma non a cellule di altri tessuti (come neuroni o epatociti)).
-unipotenti—->possono originare un solo tipo di cellula (quella della sua stessa linea). Però a differenza delle cellule non staminali esse si possono auto-rinnovare (es. cellule del fegato)
Cosa originano
-ectoderma
-mesoderma
-endoderma
-ectoderma—-> neuroni ed epitelio
-mesoderma—->cellule del sangue
-endoderma—-> cellule del fegato e del pancreas
Quali sono i due tipi di cellule pluripotenti?
-ESC (naturali)—-> derivano dall’embrione (non utilizzabili per motivi etici)
-iPSC(indotte)—-> si parte dai fibroblasti di qualsiasi tipo di cellula (es. neuroni, epiteliali,….) e si aggiungono 4 fattori di trascrizione OCT-4, SOx- 2, KLF-4 e MYC.
Non danno problemi di rigetto perchè derivano dai fibroblasti del paziente stesso
Dimmi 2 cose sulle AdSCs cells (cellule staminali adulte)
-sono cellule staminali che
derivano dagli organi già formati,
(ad esempio nei polmoni ci
sono delle cellule staminali, che vengono prese, messe in cultura
e facendo ciò si otterranno gli organoidi dei polmoni)
-le cellule multipotenti e pluripotenti sono esempi di cellule staminali adulte
Come ottengo gli organoidi da
-cellule staminali pluripotenti
-cellule staminali adulte
-derivati da PSC—->
*specifica dello stato germinale (ectoderma, mesoderma, endoderma)
*induzione e maturazione con fattori di crescita
-derivati da AdSCs—->
* l’isolamento
della popolazione di cellule staminali specifiche del tessuto
*inserimento in matrice extracellulare assieme a componenti di segnalazione che devono essere attivati e altri che devono essere inibiti per favorire la proliferazione
Di che tipo sono gli organoidi che derivano da
-cellule staminali pluripotenti
-cellule staminali adulte
-derivati da cellule pluripotenti—-> qualsiasi tipo
-derivati da cellule staminali adulte—-> solo di origine epiteliale (ma mancano di componente mesenchimale e immunitaria)
