Lezione 17-18:Protein Folding + Folding Delle Proteine Nel RE

Question 1

Qual è il 21 aa?

Answer 1

Selenocisteina (è come Cys, ma invece dello S ha il Se)

Question 2

Quali sono i 2 tipi di struttura secondaria?

Answer 2

• alfa elica—->
  *nelle proteine globulari o transmembrana
  *forma elicoidale
  *si formano legami a H tra il CO di un aa e l’NH dell’aa x+4
  *residui laterali R sporgono all’esterno

-foglietto beta—->
*struttura planare
*si formano legami a Htra CO e NH
*i residui laterali sporgono o sopra o sotto
*può essere parallelo (le regioni, amminoterminali sono tutte dallo stesso lato)/ antiparallelo (le regioni amminoterminali sono su lati opposti)

Question 4

Quali legami permettono la formazione della struttura secondaria di una proteina?

Answer 4

I legami a H

Question 5

Che cosa fa sì che la proteina si ripieghi a dare una struttura terziaria?

Answer 5

Le forze elettrostatiche e idrofobiche che si ottengono tra i residui laterali R

Question 6

In che tipo di struttura terziaria si organizzano le alfa eliche?

Answer 6

Coiled coil—-> abbiamo due o più α eliche che si arrotolano l’una sull’altra, in modo parallelo o antiparallelo

Question 7

Quali sono i 2 tipi di struttura terziaria in cui si organizzano i foglietti beta?

Answer 7

-B-barrel (strutture a barile beta)—-> formate da catene laterali apolari all’esterno, a contatto con catene idrofobiche dei fosfolipidi di membrana, e catene laterali polari verso l’interno

-domini di immunoglobulina

Question 8

Cos’è il dominio di una proteina?

Answer 8

una parte di una proteina che è in grado di
-esistere da sola,
-raggiungere sua struttura tridimensionale corretta da sola
-che si è probabilmente evoluta indipendentemente dal
resto della proteina.

Question 9

Se conosco la sequenza amminoacidica di una proteina posso immaginare la funzione di quella proteina?

Answer 9

Se
ho la sequenza di una proteina che non conosco, posso trovare delle similitudini con altre proteine e
immaginare che una proteina con sequenza simile abbia una funzione simile, ma non è detto che sia così

Question 10

Cosa sono le proteine o intrinsecamente disordinate?

Answer 10

Sono proteine che non hanno un’unica struttura
tridimensionale foldata, ma continuano ad oscillare tra
tante conformazioni diverse e questo permette loro di
interagire con substrati diversi, infatti raggiungono una
struttura tridimensionale stabile solo nel momento in cui interagiscono con un substrato.

Question 11

Fammi un esempio di proteine intrinsecamente disordinate

Answer 11

Molecole di signaling

Question 12

Cos’è il folding delle proteine?

Answer 12

Il folding delle proteine è quel processo tramite il quale da una struttura
lineare di amminoacidi si arriva ad una struttura tridimensionale

Question 13

In cosa consiste l’esperimento di Anfisen?

Answer 13

-denatura la proteina RNAse (ribonucleasi A) conl’urea (agente denaturante: rompe i legami a H) e il mercaptoetanolo (agente riducente: rompe ponti di solfuro)

-con la dialisi vengono eliminati gli agenti denaturanti

-RNAse ritorna alla sua struttura terziaria

QUINDI la struttura
tridimensionale delle proteine è contenuta nella sequenza amminoacidica (struttura primaria)

Question 14

Bisogna fornire energia per far raggiungere lo stato nativo ad una proteina misfolded?

Answer 14

Sì

Question 15

Dimmi 2 cose sugli aggregati proteici

Answer 15

-sono ancora più stabili dello stato nativo della proteina (hanno energia ancora più bassa)

-possono essere tossisci (es.B amiloidi)

Question 16

Cos’è lo stato nativo di una proteina?

Answer 16

La sua struttura funzionante (es. terziari o quaternaria)

Question 17

Dimmi 3 cose sui chaperones

Answer 17

sono proteine
che assistono il folding di altre proteine.

Fanno in modo che la proteina non rimanga intrappolata in stati misfolded.

Sono anche dette HSP (heat shock protein)—-> la loro trascrizione aumenta dopo un heat shock (shock termico)

Question 18

Quali sono le grandi famiglie di chaperones in base a
-struttura
-funzione?

Answer 18

-a seconda della struttura—->HSP60, HSP70, HSP90, HSP100.

-a seconda della funzione—-> chaperon foldasi, chaperon holdasi.

Question 19

qual è la differenzarenza tra chaperon foldasi, chaperon holdasi.

Answer 19

Chaperon foldasi—->favoriscono il folding corretto. Possono correggere errori di folding.
Es.HSP 60 e HSP70 (in alcuni casi)

Chaperones holdasi—-> prevengono l’aggregazione di proteine (infatti se ci sono proteine infonde con i residui idrofobici liberi potrebbero entrare in contatto con altre proteine unfolded e formare aggregati) , ma non favoriscono direttamente il folding.
Es.HSP70, HSP40

Question 20

Qual è la struttura della HSP60?

Answer 20

Ha forma cilindrica e presenta 2 camere che servono per accogliere la proteina da foldare

Question 21

Come agisce la HSP60?

Answer 21

Question 22

Perchè la HSP60 non funziona per il folding dio tutte le proteine?

Answer 22

-Le proteine di membrana, che devono avere regioni idrofobiche esposte, non possono essere ripiegate in questo modo (perchè in questo modo le regioni idrofobiche vengono nascoste e vengono esposte quelle idrofiliche)

• La dimensione è un limite: se una proteina è troppo grande, non
entra nella camera.

Question 23

Qual è la struttura di HSP70?

Answer 23

2 domini
-un dominio che lega ATP
-un dominio che lega il substrato (ha anche una struttura che funge da coperchio)

Question 24

Come funziona HSP70?

Answer 24

1) ATP si lega al dominio di HSP70 che lega ATP
2) si apre il coperchio del dominio di HSP70 che lega il substrato (così HSP lega il substrato)
3)viene idrolizzato ATP e HSP70 cambia conformazione
4)il cambiamento conformazionale di HSP70 induce un cambiamento conformazionale nel substrato
5)una proteina scambiatrice toglie ADP e mette ATP nel dominio di HSP70
6)HSP può legare un altro substrato

(Questo metodo non ha limitazioni di dimensioni)

Question 25

Quali sono gli organelli che fanno parte della via secretoria?

Answer 25

-RE -apparato di golgi -lisosomi -endosomi

Question 26

Cos’è la traslocazione?

Answer 26

l’ingresso delle proteine nella via secretoria

Question 27

Quando avviene la traslocazione?

Answer 27

Durante la traduzione della proteina (è un processo cotraduzionale)

Question 28

Come fa la cellula a capire che una proteina che sta venendo tradotta deve entrare nella via secretoria?

Answer 28

Questa proteina possiede una “sequenza segnale” o “leader peptide” sulla porazione amminoterminale che viene riconosciuta dal ribosoma. RICORDA: dopo che la proteina è stata trasportata nel RE la sequenza segnale viene tagliata via

Question 29

Qual è la sequenza segnale che fa capire al ribosoma che una proteina deve entrare nella via secretoria?

Answer 29

-una regione idrofobica, -aa con cariche positive all’N terminale -amminoacido polare non carico verso la regione C terminale. -sito di taglio

Question 30

Come avviene la traslocazione di una proteina solubile nel RE?

Answer 30

- Il ribosoma inizia a sintetizzare la proteina; - Viene esposta la signal sequence; - SRP (Signal Recognition Particle) riconosce la signal sequence, si lega al ribosoma e blocca momentaneamente la traduzione; - Il complesso ribosoma+ SRP viene portato alla membrana del reticolo endoplasmatico e si associa ad essa tramite SRP receptor - SRP viene rilasciato tramite idrolisi di GTP; - si apre il canale Sec61e il ribosoma riprende la traduzione della proteina che così viene rilasciata nel RE (dopo che la proteina è stat rilasciata Sec61 si chiude) -nel RE la signal sequence viene tagliata; RICORDA! Sec61 non è sempre aperto perché è necessario controllare ciò che entra nel reticolo endoplasmatico. Infatti, ha un tappo che usa quando la proteina non lo sta usando.

Question 31

L’ingresso delle proteine nel nucleo o negli altri organelli cellulari (tranne RE) avviene contemporaneamente o dopo la traduzione della proteina?

Answer 31

Dopo

Question 32

Cos’è Sec61?

Answer 32

-è un traslocone (canale del RE che permette l’ingresso della proteina nel RE)

Question 33

Quali sono i vari tipi di proteine di membrana (insolubili)? Fai es.

Answer 33

-tipo I—-> recettore tiorosin-chinasico dell’insulina (estremità N-terminale nel lume del RE, che poi migrerà e finirà nello spazio eextracellulare/ dominio C-terminale nel citosol) -tipo II—-> l'estremità N-terminale posizionata nel citosol e l'estremità C-terminale all'interno del lume del RE. In questo caso la signal sequence non viene rimossa (funge da regione transmembrana) e ha aa positivi all’N-terminale -tipo III—-> estremità N-terminale nel lume del RE e l’estremità C-terminale nel citosol (come tipo I) ma in questo caso la sequenza segnale non viene rimossa -tipo superiore (con più transmembrana)—-> es. recettori accoppiati alle proteine G (GPCR): recettori a 7-alfa eliche transmembrana con l’estremnità N-terminale nel citosol e l’estremità C terminale nel lume del RE. Anche in questo caso la signal sequence funge da regione transmembrana e non viene eliminata

Question 34

Come fanno le proteine di membrana (insolubili) ad associarsi alla membrana?

Answer 34

Vengono traslocate nel RE, qui vengono modificate e così si associano alla membrana

Question 35

Come avviene il folding delle proteine transmembrana di tipo I?

Answer 35

-Il ribosoma, insieme alla proteina in sintesi, viene guidato verso il complesso di traslocazione SEC61 -Dopo l'ingresso della proteina nel RE la sequenza leader viene rimossa, consentendo alla sintesi proteica di continuare. -Quando viene sintetizzata la regione transmembrana, caratterizzata da un'alfa-elica idrofobica, il canale SEC61 si apre lateralmente, permettendo alla regione transmembrana di integrarsi nella membrana. Questa regione funge da segnale di arresto per la traslocazione, mentre la sintesi della proteina continua, portando infine all'incorporazione della proteina nella membrana cellulare.

Question 36

Come avviene il folding delle proteine di membrana tipo II?

Answer 36

In questo caso, la sequenza segnale (Leader sequence) presenta caratteristiche specifiche, infatti è caratterizzata da amminoacidi carichi positivamente a N-terminale ; essa funge anche da parte transmembrana e non viene quindi rimossa(inserita in membrana). Questa sequenza guida il ribosoma, insieme alla proteina in fase di sintesi, verso il RE. Quando la proteina entra in contatto con il complesso Sec61, avviene una traslocazione laterale, consentendo la continuazione della sintesi proteica. In questo processo, è il C-terminale a essere esposto nel lume del RE, mentre l'estremità N-terminale rimane nel citosol

Question 37

Come avviene il folding delle proteine transmembrana di tipo superiore?

Answer 37

Durante il processo di sintesi, la regione transmembrana agisce come un punto di arresto per il passaggio della proteina attraverso il traslocone. Ad esempio, quando la prima elica transmembrana viene inserita, la sintesi della proteina continua e la catena polipeptidica scorre attraverso il traslocone. Quando entra in gioco la seconda elica transmembrana, questa (ossi la I alfa elica) viene traslocata lateralmente, interrompendo il flusso della proteina attraverso il traslocone. La sintesi prosegue con l'inserimento di ulteriori eliche transmembrana, seguendo lo stesso meccanismo

Question 38

Qual è la struttura di Sec61?

Answer 38

È composto da alfa eliche che formano un cilindro con un poro centrale e può aprirsi lateralmente (serve es. per la traslocazione delle proteine transmembrana)

Question 39

Come fanno le proteine associate alla membrana del RE (trailanchored proteins) ad ancorarsi alla membrana?

Answer 39

Esclusivamente tramite l’estremità C-terminale

Question 40

Fammi un esempio di proteine associate alla membrana del RE (trailanchored proteins)

Answer 40

Citocromo B

Question 41

Fammi un esempio di proteine la cui traslocazione nella via secretoria avviene dopo la traduzione della proteina e non in maniera co-traduzionale

Answer 41

proteine associate alla membrana del RE (trailanchored proteins)

Question 42

Come avviene la traslocazione delle proteine associate alla membrana del RE (trailanchored proteins) ?

Answer 42

-dopo che la proteina è stata completamente sintetizzata viene riconosciuta da un complesso apposito che lavora in collaborazione con un ATPasi (GAP3) che la porta a un traslocatore apposito sulla membrana del RE (complessi GAP1 e GAP2) e la inserisce nella membrana del RE -Dopo che una proteina é entrata nel lume del RE, deve avvenire il folding proteico. Questo è un processo termodinamico abbastanza difficoltoso (può avvenire un misfolding) poiché il RE é un ambiente molto concentrato. Per ovviare a questo problema si usano diversi enzimi e Chaperone.

Question 43

Dimmi 4 esempi di chaperoni usati per il folding delle proteine associate alla membrana del RE (trailanchored proteins)

Answer 43

-lectine—-> riconoscono alcuni zuccheri -proline -HSP47—> esclusiva per il collagene (perchè il suo foldin è molto complicato, quindi richiede un chaperones specifico) -tapasina—-> esclusiva per le NHC di classe I

Question 44

Cos’è la BiP (Immunoglobulin binding protein)

Answer 44

È uno dei chaperones HSP70

Question 45

Qual è la struttura di BiP (Immunoglobulin binding protein)

Answer 45

2 DOMINI (come HSP70): un dominio che lega il substrato e uno che lega l’ATP per catalizzare il folding

Question 46

Come funziona BiP (Immunoglobulin binding protein)

Answer 46

-si parte con una conformazione in cui BiP é aperta e legata ad ATP, -si legano poi il substrato e un co-chaperon (proteina J), - BiP idrolizza l’ATP e rilascia il fosfato (idrolizza ATP in ADP) e il co-chaperon. -BiP si chiude ed ora ha legata dell’ADP -interviene un nucleotide excange factor (Sil1) che si lega a BiP e scambia ATP con ADP (“ricarica” la proteina di energia) così che BiP possa tornare alla sua forma originale e rilasciare il substrato.

Question 47

Dimmi loe 4 modifiche post tradizionali che subisce una proteina traslocata nel RE

Answer 47

-taglio della leader sequence/signal sequence -glicosilazione -formazione di ponti disolfuro -idrossilazione di Pro a Lys -aggiunta della coda GPI

Question 48

In cosa consiste la glicosilazione delle proteine traslocate nel RE?

Answer 48

Aggiunta di uno zucchero formato da 2 N- acetilglucosammina, 9 mannosi e 3 glucosi

Question 49

Qual è’ la sequenza consenso che permette la N-glicosilazione delle proteine?

Answer 49

Asp-X (tranne Pro)- Ser/Thr

Question 50

Come avviene la glicosilazione delle proteine?

Answer 50

-viene aggiunto lo zucchero formato da 2 N-acetilglucosammine, 9 mannosi e 3 glucosi SUCCESSIVAMENTE AVVIENE IL TAGLIO DA PARTE DEGLI ENZIMI -la glucosidasi 1 taglia il primo glucosio, la glucosidasi 2 taglia il secondo glucosio -Questa struttura viene riconosciuta da due lectine che fanno da chaperon aiutandone il folding -la glucosidasi 2 taglia l’ultimo glucosio, le lectine rilasciano quindi la proteina che, se é riuscita a foldarsi, prosegue nella via secretoria -se la proteina non è riuscita a foldarsi interviene UGGT lega la proteina e le riattacca un glucosio per ripetere il processo. Se la proteina proprio non riesce a foldarsi, la mannosidasi taglia il mannosio così che UGGT non riconosca più la proteina e venga degradata

Question 51

I ponti disolfuro si formano in ambiente ossidante o riducente? Quindi in quali compartimenti cellulari?

Answer 51

-ambiente ossidante -ambiente extracellulare e nel RE

Question 52

Cosa succede se -una proteina ha un ponte disolfuro sbagliato -non si riescono a correggere i ponti disolfuro sbagliati?

Answer 52

-una proteina ha un ponte disolfuro sbagliato—-> la ossidoriduttasi in forma ridotta attacca il ponte sbagliato e aiuta a formare il ponte corretto (isomerizzazione), alla fine del processo l’enzima é ancora ridotto e la proteina si è ox -non si riescono a correggere i ponti disolfuro sbagliati—-> la proteina deve essere de3gradata e quindi l’enzima ridotto attacca la proteina e si prende il suo ponte, la proteina si é ridotta mentre l’enzima si é ossidato.

Question 53

Quali enzimi aiutano la formazione di ponti disolfuro?

Answer 53

Le ossidoreduttasi (infatti la formazione dei ponti disolfuro è un’OXRED: -la proteina si ossida -l’enzima si riduce)

Question 54

Cosa sono i lisosomi?

Answer 54

I lisosomi sono organuli con azione digestiva, degradano tutte le macromolecole biologiche della cellula grazie a enzimi specifici che ricevono dalla via secretoria.

Question 55

Come vengono prodotti gli enzimi lisosomiali?

Answer 55

-dopo essere stato glicosilazione nel RE, l’enzima va nel golgi -Alle proteine glicosilate nel RE viene associata una n- acetilglucosammina fosfato e si ottine una proteina che ha sul mannosio un fosfato in posizione 6. -La presenza del fosfato in quella posizione, nel golgi, fa sì che la proteina venga riconosciuta da un recettore per il mannosio 6 fosfato -il recettore lega l’enzima lisosomale nel golgi e viene inserito in vescicole che dal golgi vanno agli endosomi che lo trasportano ai lisosomi

Question 56

Quali sono i tagli enzimatici che subisce la proteina subito dopo l’aggiunta dello zucchero durante la N-glicosilazione?

Answer 56