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Biología Molecular > Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos > Flashcards

Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards

1
Q

extracción al:

A

-DNA
-RNA

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2
Q

cuantificación y determinación de la pureza por medio de:

A

espectrofotometro

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3
Q

purificación por medio de:

A

-cromatografia de afinidad
-electroforesis:
*convencional en gel (analisis cualitativo y cuantitativo)
*campo pulsado
*capilar

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4
Q
  1. muestra de células
A

por ejemplo:
-piel
-cabello
-de la mucosa bucal
-sangre (CMSP)
*gradiente de fincoll

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5
Q

celulas polimorfonucleares

A

-granulocitos
*neutrofilos 62
*eosinofilos 2.3
*basofilos 0.4

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6
Q

celulas mononucleares

A

-agranulocitos
*monocitos 5.3
*linfocitos 30

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7
Q
  1. buffer de lisis
    contiene:
A

-50mM Tris-HCl ph 8
-1% SDS (dodecil sulfato de sodio)
-proteasa, proteinasa K (2mg/ml)

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8
Q

buffer para mantener el ph en el cual el dna se mantiene estable y con carga negativa

A

50mM Tris-HCl ph 8

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9
Q

-detergente anionico para romper las membranas promoviendo la liberación de dna
-desnaturaliza las proteinas (inactivando p, ej. DNAsas) dejandolas accesibles para la proteasa

A

1% SDS (dodecil sulfato de sodio)

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10
Q

cuando el SDS entra en contacto con la célula…

A

captura los lipidos y las proteinas, el acido nucleico permanece en solución

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11
Q

-aislada del hongo tritirachium album
-serina proteasa activa bajo condiciones desnaturalizantes
-altamente activa sobre proteinas nativas y desnaturalizantes
-capaz de inactivar las RNAsas y las DNAsas
-destruir proteinas que crean un enlace con el dna (ej, histonas, factores de transcripción, polimerasas)

A

proteinasa k

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12
Q

incrementa:
-la pureza del DNA, menor contaminación por proteinas
-la calidad/cantidad de DNA no degradado

A

proteinasa K

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13
Q
  1. precipitación de proteinas:
A

-p, ej. con soluciones de acetona
-las proteinas se insolubilizan y precipitan
-se puede separar por centrifugación, quedando en el prepicipitado (pellet), junto con los restos celulares
-en el sobrenadante se encuentra el acio nucleico

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14
Q
  1. precipitación de dna
A

-alta concentración de sales NaCl
-los iones na+ neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
-las moleculas de dna se juntan en lugar de repelerse una a la otra
-se disminuye la solubilidad del dna en el ambiente acuoso
-de esta manera se facilita la precipitación del dna al añadir el alcohol

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15
Q

-es una molecula menos polar que el agua
-es misicible con el agua

A

alcohol frio (etanol)

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16
Q

la polaridad del RNA es __________ que la del DNA por lo que no precipita

A

mayor

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17
Q

el dna no es soluble en ….

A

ETANOL por lo que al agregarse a la solución de ácidos nucleicos anteriormente obtenida, el dna precipita

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18
Q

al disminuir la t° el DNA

A

se insolubiza aun mas (incubacion en hielo)

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19
Q
  1. lavados
A

-se lava un par de veces con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el dna

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20
Q
  1. resuspención del dna
A

-se solubiliza en agua libre de nucleasas (ej. 25-100ul)

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21
Q
  1. concentración y pureza
A

-los espectros de absorbancia de acidos nucleicos y proteinas (compuestos aromaticos, fenoles) muestran niveles maximos a 260-280nm, respectivamente
-el espectrofotometro calcula la concentración de acidos nucleicos en la solución en base a la absorbancia a 260nm
-la pureza se determina mediante el coeficiente 260/280

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22
Q

1.8-2

A

optima

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23
Q

1.6-1.8

A

aceptable

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24
Q

-1.6

A

contaminación con compuestos aromaticos y proteinas

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25
Q

+2.1

A

contaminación con rna

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26
Q

extracción de RNA

A

-metodo del fenol-cloroformo (inicialmente en fase continua)

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27
Q

metodo del fenol-cloroformo
paso 1

A

rompe membranas, desnaturaliza proteinas y libera los acidos nucleicos de moleculas asociadas

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28
Q

metodo del fenol-cloroformo
paso 2

A

la adición de mas cloroformo separa las fases
-polaridad fenol + cloroformo
-el dna menos polar que el rna se queda entre las fases acuosa y fenolica junto con las proteinas
-el rna permanece disuelto en la fase acuosa

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29
Q

metodo del fenol-cloroformo
paso 3

A

se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (isopropanol) frio

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30
Q

el isopropanol es un alcohol menor polar que

A

el etanol

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31
Q

metodo del fenol-cloroformo
4,5,6,7

A
  1. centrifugar
  2. lavar el pellet EtOH 75%
  3. resuspender el rna
  4. coeficiente 260/280
32
Q

rna
2.0-2.2

A

optima

33
Q

rna
+1.7

A

aceptable

34
Q

rna
-1.7

A

contaminación con compuestos aromaticos y proteinas

35
Q

el fenol es _____ polar que el cloroformo

A

mas

36
Q

cromatografia de afinidad para separar acidos nucleicos, p, ej

A

mRNA

37
Q

factores instrinsecos a la particula

A

-relacion carga/masa
-peso molecular

38
Q

factores extrinsecos a la particula

A

-concentracion de agarosa
-voltaje aplicado
-tiempo de corrida
-t°

39
Q

agarosa es

A

-un polisacarido formado por B-1-4-3-6-anhidro-L-galactosa y a-1-3-D-galactosa
-soluble en agua a t° superiores a 65°
-forma una matriz inerte y no toxica

40
Q

concentracion de agarosa

A

-tipicamente de 0.5 a 4% (peso/volumen)

41
Q

la movilidad disminuye al _________ el porcentaje de agarosa

A

aumentar

42
Q

voltaje aplicado tipico

A

-10V/cm de gel

43
Q

voltaje aplicado en geles de 10-15cm

A

100v-130v

44
Q

al incrementar el voltaje la movilidad _________, aunque no necesariamente incrementa la resolucion

A

aumenta

45
Q

mejor resolución (5v/cm de gel)

A

voltajes menores (ej 70mv)

46
Q

a menor voltaje…

A

mayor difusión lateral

47
Q

a mayor tiempo de corrida….

A

mayor resolución

48
Q

temperatura:

A

-al incrementar la t°, la movilidad incrementa como si hubiera disminuido la concentración de agarosa
-precaución: si la t° se incrementa mucho se puede fundir el gel
-normalmente la t° se mantiene lo mas baja posible

49
Q

a mayor voltaje y mayor tiempo de corrida…

A

mayor temperatura y la movilidad

50
Q

revelado y visualización de acidos nucleicos con:

A

-bromuro de etidio
-SYBR

51
Q

bromuro de etidio

A

-se intercala entre las bases
-absorbe a 260-360 (uv) y emite fluorescencia rojo naranja (560nm)
-detecta hasta un ng de dsDNA
-en la agarosa o post corrida

52
Q

SYBR

A

-no intercalante
-alternativa menos toxica aunque menos sensible (-3ng)

53
Q

-mezcla de moleculas (acido nucleico) de diferente peso molecular que sirve como referencia para el analisis cualitativo (determinacion del peso molecular aproximado de una banda especifica) de las muestras analizadas
+sinteticos (ej 100pb, 1kb)
+dna de fagos o plasmidos digeridos por enzimas de restricción (endonucleasas especificas de secuencia)

A

marcadores de peso molecular

54
Q

analisis cualitativo
no se puede conocer…

A

el numero exacto de pb de las bandas en el corrimiento de las muestras, por eso se habla de peso molecular aparente

55
Q

analisis de retraso en gel

A

-EMSA
Electroforesis mobility shoft assay
-basada en la interaccion entre acidos nucleicos y proteinas
-los complejos acidos nucleicos-proteinas tienen un peso molecular mayor por lo cual la movilidad del acido nucleico correspondiente disminuye (se retrasa su avance en el gel)
-permite detectar interacciones entre la secuencia especifica de acido nucleuco (ej tfbs) y alguna proteina funcional particular (ej factor de transcripción)

56
Q

mayor resolucion empleando un voltaje ____________ desde luego mayor tiempo de corrida y posiblemente un % mayor de agarosa

A

menor

57
Q

-separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de bases)
-reorientación de la molecula mediante cambios periodicos en la orientacion de campo electrico E1 y E2

A

electroforesis en gel de campo pulsado

58
Q

al aplicar E1 las cadenas de…

A

DNA se estiran y orientan en esa dirección

59
Q

al aplicar E2 mas o menos perpendiculares a…

A

E1, se obliga a las cadenas de DNA a relajarse, elongarse y alinearse en una nueva dirección

60
Q

a las cadenas mas cortas les toma _______ tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad

A

menos

61
Q

aplicacion sucesiva de campos electricos

A

E1/E2/E1/E2…

62
Q

el angulo alfa de reorientacion (entre E1 y E2) es mayor a:

A

100°

63
Q

para evitar que el dna se fragmente al cargar la muestra se utilizan:

A

disoluciones concentradas de alta viscosidad o incluso celulas completas que lo contienen

64
Q

usualmente el dna genomico se digiere con…

A

enzimas de restriccion previo al corrimiento electroforetico

65
Q

geometria de los intrumentos para PFGE

A

-campos electricos no homogeneos
-campos electricos homogeneos

66
Q

campos electricos no homogeneos

A

-alfa va incrementandose
-pfge
-ofage
-rafe

67
Q

campos electricos homogeneos

A

-alfa permanece constante
-fige
-chef
-rge

68
Q

flechas largas

A

dirección neta de migración

69
Q

flechas cortas

A

vectores de fuerza de los campos electricos alternantes

70
Q

cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de dna a separar, mayor es la duración de los pulsos aplicados y ___________ el voltaje

A

menor

71
Q

-capilares de silice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas
-campo electrico alto (100-500V/cm)
-permitir obtener resultados en corto tiempo (5-60min)
-minimo consumo de muestra (nL)
-muy alta resolución, 1 nucleotido de diferencia
-muy empleada en la secuencia automatizada

A

electroforesis capilar

72
Q

el dna de un gen discontinuo __________ ____(mayor peso molecular)

A

posee intrones

73
Q

el cDNA se corresponde al mRNA, el cual ______ _____ (menor peso molecular)

A

carece de intrones

74
Q

lisis celular por sonicación:

A

l-a corriente electrica transmite su energia a un sistema mecanico que la convierte en vibraciones de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido y vibración
-en ell liquido se generan millones de burbujas microscopicas, las cuales sufren rapidisimos procesos de expanción y colapso

75
Q

DNA genomico puede :

A

-lisis celular por sonicación
-degradación por acción de DNAasas durante la extracción

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