Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos

Question 1

extracción al:

Answer 1

-DNA
-RNA

Question 2

cuantificación y determinación de la pureza por medio de:

Answer 2

espectrofotometro

Question 3

purificación por medio de:

Answer 3

-cromatografia de afinidad
-electroforesis:
*convencional en gel (analisis cualitativo y cuantitativo)
*campo pulsado
*capilar

Question 4

1. muestra de células

Answer 4

por ejemplo:
-piel
-cabello
-de la mucosa bucal
-sangre (CMSP)
*gradiente de fincoll

Question 5

celulas polimorfonucleares

Answer 5

-granulocitos
*neutrofilos 62
*eosinofilos 2.3
*basofilos 0.4

Question 6

celulas mononucleares

Answer 6

-agranulocitos
*monocitos 5.3
*linfocitos 30

Question 7

2. buffer de lisis
   contiene:

Answer 7

-50mM Tris-HCl ph 8
-1% SDS (dodecil sulfato de sodio)
-proteasa, proteinasa K (2mg/ml)

Question 8

buffer para mantener el ph en el cual el dna se mantiene estable y con carga negativa

Answer 8

50mM Tris-HCl ph 8

Question 9

-detergente anionico para romper las membranas promoviendo la liberación de dna
-desnaturaliza las proteinas (inactivando p, ej. DNAsas) dejandolas accesibles para la proteasa

Answer 9

1% SDS (dodecil sulfato de sodio)

Question 10

cuando el SDS entra en contacto con la célula…

Answer 10

captura los lipidos y las proteinas, el acido nucleico permanece en solución

Question 11

-aislada del hongo tritirachium album
-serina proteasa activa bajo condiciones desnaturalizantes
-altamente activa sobre proteinas nativas y desnaturalizantes
-capaz de inactivar las RNAsas y las DNAsas
-destruir proteinas que crean un enlace con el dna (ej, histonas, factores de transcripción, polimerasas)

Answer 11

proteinasa k

Question 12

incrementa:
-la pureza del DNA, menor contaminación por proteinas
-la calidad/cantidad de DNA no degradado

Answer 12

proteinasa K

Question 13

3. precipitación de proteinas:

Answer 13

-p, ej. con soluciones de acetona
-las proteinas se insolubilizan y precipitan
-se puede separar por centrifugación, quedando en el prepicipitado (pellet), junto con los restos celulares
-en el sobrenadante se encuentra el acio nucleico

Question 14

4. precipitación de dna

Answer 14

-alta concentración de sales NaCl
-los iones na+ neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
-las moleculas de dna se juntan en lugar de repelerse una a la otra
-se disminuye la solubilidad del dna en el ambiente acuoso
-de esta manera se facilita la precipitación del dna al añadir el alcohol

Question 15

-es una molecula menos polar que el agua
-es misicible con el agua

Answer 15

alcohol frio (etanol)

Question 16

la polaridad del RNA es __________ que la del DNA por lo que no precipita

Answer 16

mayor

Question 17

el dna no es soluble en ….

Answer 17

ETANOL por lo que al agregarse a la solución de ácidos nucleicos anteriormente obtenida, el dna precipita

Question 18

al disminuir la t° el DNA

Answer 18

se insolubiza aun mas (incubacion en hielo)

Question 19

5. lavados

Answer 19

-se lava un par de veces con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el dna

Question 20

6. resuspención del dna

Answer 20

-se solubiliza en agua libre de nucleasas (ej. 25-100ul)

Question 21

7. concentración y pureza

Answer 21

-los espectros de absorbancia de acidos nucleicos y proteinas (compuestos aromaticos, fenoles) muestran niveles maximos a 260-280nm, respectivamente
-el espectrofotometro calcula la concentración de acidos nucleicos en la solución en base a la absorbancia a 260nm
-la pureza se determina mediante el coeficiente 260/280

Question 22

1.8-2

Answer 22

optima

Question 23

1.6-1.8

Answer 23

aceptable

Question 24

-1.6

Answer 24

contaminación con compuestos aromaticos y proteinas

Question 25

+2.1

Answer 25

contaminación con rna

Question 26

extracción de RNA

Answer 26

-metodo del fenol-cloroformo (inicialmente en fase continua)

Question 27

metodo del fenol-cloroformo paso 1

Answer 27

rompe membranas, desnaturaliza proteinas y libera los acidos nucleicos de moleculas asociadas

Question 28

metodo del fenol-cloroformo paso 2

Answer 28

la adición de mas cloroformo separa las fases -polaridad fenol + cloroformo -el dna menos polar que el rna se queda entre las fases acuosa y fenolica junto con las proteinas -el rna permanece disuelto en la fase acuosa

Question 29

metodo del fenol-cloroformo paso 3

Answer 29

se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (isopropanol) frio

Question 30

el isopropanol es un alcohol menor polar que

Answer 30

el etanol

Question 31

metodo del fenol-cloroformo 4,5,6,7

Answer 31

4. centrifugar 5. lavar el pellet EtOH 75% 6. resuspender el rna 7. coeficiente 260/280

Question 32

rna 2.0-2.2

Answer 32

optima

Question 33

rna +1.7

Answer 33

aceptable

Question 34

rna -1.7

Answer 34

contaminación con compuestos aromaticos y proteinas

Question 35

el fenol es _____ polar que el cloroformo

Answer 35

mas

Question 36

cromatografia de afinidad para separar acidos nucleicos, p, ej

Answer 36

mRNA

Question 37

factores instrinsecos a la particula

Answer 37

-relacion carga/masa -peso molecular

Question 38

factores extrinsecos a la particula

Answer 38

-concentracion de agarosa -voltaje aplicado -tiempo de corrida -t°

Question 39

agarosa es

Answer 39

-un polisacarido formado por B-1-4-3-6-anhidro-L-galactosa y a-1-3-D-galactosa -soluble en agua a t° superiores a 65° -forma una matriz inerte y no toxica

Question 40

concentracion de agarosa

Answer 40

-tipicamente de 0.5 a 4% (peso/volumen)

Question 41

la movilidad disminuye al _________ el porcentaje de agarosa

Answer 41

aumentar

Question 42

voltaje aplicado tipico

Answer 42

-10V/cm de gel

Question 43

voltaje aplicado en geles de 10-15cm

Answer 43

100v-130v

Question 44

al incrementar el voltaje la movilidad _________, aunque no necesariamente incrementa la resolucion

Answer 44

aumenta

Question 45

mejor resolución (5v/cm de gel)

Answer 45

voltajes menores (ej 70mv)

Question 46

a menor voltaje...

Answer 46

mayor difusión lateral

Question 47

a mayor tiempo de corrida....

Answer 47

mayor resolución

Question 48

temperatura:

Answer 48

-al incrementar la t°, la movilidad incrementa como si hubiera disminuido la concentración de agarosa -precaución: si la t° se incrementa mucho se puede fundir el gel -normalmente la t° se mantiene lo mas baja posible

Question 49

a mayor voltaje y mayor tiempo de corrida...

Answer 49

mayor temperatura y la movilidad

Question 50

revelado y visualización de acidos nucleicos con:

Answer 50

-bromuro de etidio -SYBR

Question 51

bromuro de etidio

Answer 51

-se intercala entre las bases -absorbe a 260-360 (uv) y emite fluorescencia rojo naranja (560nm) -detecta hasta un ng de dsDNA -en la agarosa o post corrida

Question 52

SYBR

Answer 52

-no intercalante -alternativa menos toxica aunque menos sensible (-3ng)

Question 53

-mezcla de moleculas (acido nucleico) de diferente peso molecular que sirve como referencia para el analisis cualitativo (determinacion del peso molecular aproximado de una banda especifica) de las muestras analizadas +sinteticos (ej 100pb, 1kb) +dna de fagos o plasmidos digeridos por enzimas de restricción (endonucleasas especificas de secuencia)

Answer 53

marcadores de peso molecular

Question 54

analisis cualitativo no se puede conocer...

Answer 54

el numero exacto de pb de las bandas en el corrimiento de las muestras, por eso se habla de peso molecular aparente

Question 55

analisis de retraso en gel

Answer 55

-EMSA Electroforesis mobility shoft assay -basada en la interaccion entre acidos nucleicos y proteinas -los complejos acidos nucleicos-proteinas tienen un peso molecular mayor por lo cual la movilidad del acido nucleico correspondiente disminuye (se retrasa su avance en el gel) -permite detectar interacciones entre la secuencia especifica de acido nucleuco (ej tfbs) y alguna proteina funcional particular (ej factor de transcripción)

Question 56

mayor resolucion empleando un voltaje ____________ desde luego mayor tiempo de corrida y posiblemente un % mayor de agarosa

Answer 56

menor

Question 57

-separación de grandes fragmentos de DNA (hasta millones de bases) -reorientación de la molecula mediante cambios periodicos en la orientacion de campo electrico E1 y E2

Answer 57

electroforesis en gel de campo pulsado

Question 58

al aplicar E1 las cadenas de...

Answer 58

DNA se estiran y orientan en esa dirección

Question 59

al aplicar E2 mas o menos perpendiculares a...

Answer 59

E1, se obliga a las cadenas de DNA a relajarse, elongarse y alinearse en una nueva dirección

Question 60

a las cadenas mas cortas les toma _______ tiempo reorientarse y exhiben mayor movilidad

Answer 60

menos

Question 61

aplicacion sucesiva de campos electricos

Answer 61

E1/E2/E1/E2...

Question 62

el angulo alfa de reorientacion (entre E1 y E2) es mayor a:

Answer 62

100°

Question 63

para evitar que el dna se fragmente al cargar la muestra se utilizan:

Answer 63

disoluciones concentradas de alta viscosidad o incluso celulas completas que lo contienen

Question 64

usualmente el dna genomico se digiere con...

Answer 64

enzimas de restriccion previo al corrimiento electroforetico

Question 65

geometria de los intrumentos para PFGE

Answer 65

-campos electricos no homogeneos -campos electricos homogeneos

Question 66

campos electricos no homogeneos

Answer 66

-alfa va incrementandose -pfge -ofage -rafe

Question 67

campos electricos homogeneos

Answer 67

-alfa permanece constante -fige -chef -rge

Question 68

flechas largas

Answer 68

dirección neta de migración

Question 69

flechas cortas

Answer 69

vectores de fuerza de los campos electricos alternantes

Question 70

cuanto mayor es el tamaño de las cadenas de dna a separar, mayor es la duración de los pulsos aplicados y ___________ el voltaje

Answer 70

menor

Question 71

-capilares de silice (SiO2) flexibles recubiertos de poliamidas -campo electrico alto (100-500V/cm) -permitir obtener resultados en corto tiempo (5-60min) -minimo consumo de muestra (nL) -muy alta resolución, 1 nucleotido de diferencia -muy empleada en la secuencia automatizada

Answer 71

electroforesis capilar

Question 72

el dna de un gen discontinuo __________ ____(mayor peso molecular)

Answer 72

posee intrones

Question 73

el cDNA se corresponde al mRNA, el cual ______ _____ (menor peso molecular)

Answer 73

carece de intrones

Question 74

lisis celular por sonicación:

Answer 74

l-a corriente electrica transmite su energia a un sistema mecanico que la convierte en vibraciones de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido y vibración -en ell liquido se generan millones de burbujas microscopicas, las cuales sufren rapidisimos procesos de expanción y colapso

Question 75

DNA genomico puede :

Answer 75

-lisis celular por sonicación -degradación por acción de DNAasas durante la extracción