RT-PCR - Etapas da Técnica Flashcards
RT-PCR - Etapas 3
Extração de RNA Total
Reação de Transcrição Reversa
Reação de PCR Convencional
RNA Total - Significado
Presença dos 3 RNAs → transportador / ribossômico / mensageiro.
RNA Total - Qual utilizamos? 2
Somente mensageiro.
Restante → degradado.
Extração de RNA Total - Como fazemos?
Utilizamos reagentes, que permitem com que:
→ Pincemos a Calda Poli-A → assim isolando somente o mRNA do RNA Total
RNA - Processamento 2
CAP no C5’
Cauda Poli-A (até 250 adeninas)
Tubo - Componentes 3
RNA Total
1 Primer Oligo-dT
RNAse H
1 Primer Oligo-dT - Composição
Constituído apenas de Timina em pouca quantidade
1 Primer Oligo-dT - Função 2
Age na Calda Poli-A → onde pareia com as adeninas da mesma.
Uma vez pareado → Transcriptase Reversa identifica o último nucleotídeos do Primer → se liga → usa como molde o mRNA → e sintetiza a fita de cDNA.
1 Primer Oligo-dT - Problema
Obtemos 1 Híbrido → que contém uma fita de DNA e uma fita de RNA
RNAse H - Tipo de Enzima
Endonuclease
RNAse H - Função
Age na dupla fita híbrida → onde degrada a fita de mRNA → sobrando somente a fita de cDNA
cDNA Fita Simples - Destino
3ª Etapa → Reação de PCR Convencional.
Reação de PCR Convencional - Importância da Reação
Onde obtemos dupla fita de DNA → que é analisada por eletroforese.
