Avaliação da Resposta Imune na Prática Clínica Flashcards Preview

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Flashcards in Avaliação da Resposta Imune na Prática Clínica Deck (127):
1

O que é um imunoensaio?

Ensaio que deteta ou quantifica uma substância específica numa amostra biológica, usando o princípio da reação antigénio-anticorpo.

2

Qual é o objetivo do imunoensaio?

Estudar o sistema imune:
º Células do sistema imune;
º Proteínas do complemento;
º Avaliar resposta imune.

3

Como se avalia a resposta imune?

Através da presença de Acs:
º Acs contra Ags;
º IgEs (alergia);
º AutoAcs (doença autoimune).

4

O que são anticorpos policlonais?

Formação de clones de Acs para diferentes Ags.
Acs reconhecem diferentes epitopos no antigénio exposto.
São pouco úteis, por serem pouco específicos.

5

O que são anticorpos monoclonais?

Apenas 1 Ac para cada Ag.

6

Como se obtêm anticorpos monoclonais?

1º. Inoculação de um murganho com um determinado Ag.
2º. Retiram-se plasmócitos e faz-se a fusão destes com células do mieloma (confere IMORTALIDADE).

7

Qual a característica que permite que os imunocomplexos precipitem?

Elevado peso molecular.

8

Quais as técnicas baseadas em reacções de precipitação?

Dupla Difusão;
Imunodifusão radial (IDR);
Imunoeletroforese contracorrente;
Imunoeletroforese;
Imunoeletroforese rocket;
Imunofixação.

9

Em que consiste a imunodifusão radial (IDR)?

Técnica manual, que faz avaliação QUANTITATIVA dos anticorpos.
Avalia a presença de antigénios e a sua concentração.
1.- O antigénio é depositado nos poços de um gel que contém o anticorpo, e vai difundir em todas as direções.
2.- Na zona de equivalência Atg-Atc, o complexo imune precipita num anel concêntrico.
3.- Comparando com amostras de concentração conhecida é possível fazer uma avaliação quantitativa da concentração de Ag na amostra.
º Através da curva padrão, relaciona-se o tamanho dos halos de precipitação com a concentração de Ag.

10

Quais são as aplicações da IDR?

Quantificação de Igs, incluindo as subclasses de IgG.
Quantificação das proteínas do complemento e de outras proteínas séricas.

11

Quais as desvantagens da IDR?

Demora muito tempo, tem custos elevados.
Por causa disto, só é usada em ensaios onde não haja opção automática.
É usada em laboratório para quantificar proteínas que raramente são pedidas (C5-C9).

12

Como funcionam as reações de aglutinação?

São testes QUALITATIVOS.
Pressupõem a existência de Ags na superfície de eritrócitos e bactérias, que, se se ligarem a Acs, floculam ou aglutinam.
A aglutinação é visível a olho nu.
São testes rápidos, úteis em situações urgentes.

13

Quais são as moléculas envolvidas no processo de aglutinação?

Aglutininas - são anticorpos.
º IgM (pentamérica) - é aglutinina por excelência, por ter maior tamanho e maior capacidade de fixação do Ag.
º IgG - aglutinina pobre, exige condições ótimas de pH e temperatura para a reação.

14

Quais são as aplicações das reações de aglutinação?

Tipagem sanguínea (sistema AB0, sistema Rh).
Deteção de anticorpos antieritrocitários.
Identificação de agentes microbianos.
Deteção e titulação de anticorpos antiagente microbiano.

15

Métodos que avaliam a dispersão da luz

Automatizados.
- Avaliam interação entre imunocomplexo e radiação que o atravessa.
º Tamanho do imunocomplexo é ponto chave;
º Dispersão da luz será avaliada direta ou indiretamente.
Dois tipos:
a) Nefelometria - mede a intensidade da luz REFRATADA.
b) Turbidimetria - mede a intensidade da luz TRANSMITIDA.

16

Quais são as aplicações da nefelometria e da turbidimetria?

- Doseamento de imunoglobulinas, respetivas cadeias leves e subclasses.
- Doseamento de fatores do complemento (AH50, CH100).
- Doseamento de proteínas de fase aguda:
º PCR;
º alfa-1-antitripsina;
º ceruloplasmina;
º haptoglobina;
º fatores reumatoides;
º TASO

17

Qual o objetivo dos métodos que utilizam marcadores/sondas?

Perceber se um determinado Ag/Ac está presente na amostra, utilizando depois um Ac com fluorocromo ou enzima que, ao ligar-se, causa mudança no meio.
Todos os ensaios de marcadores/sondas servem para RASTREIO.

18

Quais os diferentes métodos que utilizam marcadores/sondas?

- Direto;
- Indireto (+ utilizado);
- Inibição ou Competitivo Indireto;
- Competitivo (mede avidez da ligação);
- Sandwich Simples;
- Sandwich Dupla.

19

Em que consiste o EIA?

(Enzyme Immuno Assay)
- Usa as propriedades catalíticas das enzimas.
- Anticorpo com enzima = Ac-E
1.- Ac-E liga-se a Ag.
2.- Adiciona-se substrato da enzima.
3.- Avalia-se:
3.1.- Diminuição do substrato;
3.2.- Aumento do produto de degradação.

20

Quais as enzimas utilizadas no EIA?

Fosfatase alcalina;
Peroxidase de rábano (HRP);
G6P desidrogenase;
Beta-galactosidase.

21

Qual a variante do EIA mais usada?

ELISA - Enzyme Lynked Immunosorbent Assay.

22

Quais as aplicações do EIA?

Doseamento de Igs, cadeias leves e subclasses;
Doseamento de avaliação funcional de fatores do complemento;
Monitorização de serologias infecciosas;
Monitorização de imunização;
Doseamento de marcadores tumorais;
Doseamento de hormonas.

23

Qual o teste usado para ensaios de avaliação de produção de citocinas e perforinas?

ELISpot.

24

Em que consiste o FEIA?

(Fluorescente Enzyme ImmunoAssay)
- Semelhante ao ELISA, mas com emissão de fluorescência.

25

Quais são os quatro elementos do FEIA?

- Ag em fase sólida;
- Ac da amostra;
- Ac com enzima conjugada;
- Substrato fluorogénico.

26

Quais as aplicações do Fluoro Immuno Assay (FIA)?

- FPIA:
º Doseamento de hormonas tiroideias (T4);
- FEIA:
º Doseamento IgE total e IgEs específicas, IgGs e IgAs específicas;
º Doseamento de proteína catiónica eosinofílica e triptase;
º Anticorpos autoimunes;
- ISAC:
º Avaliação de IgEs específicas, IgAs e IgGs específicas.

27

Como se confirma uma infeção identificada em imuno ensaio de marcador/sonda?

Eletroforese em gel = Immuno Blot (Western Blot).
Permite confirmação diagnóstica após ELISA.

28

Em que consiste o Western Blot?

Deteta proteínas específicas.
Implica:
- Separação das proteínas num gel de policrilamida;
- Transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana estável;
- Identificação da proteína com Ac específico.
Permite detetar proteínas em misturas complexas, através da deteção da ligação do anticorpo:
º Anticorpo marcado com radioisótopo ou complexo enzima-substrato.

29

Western Blot vs. ELISA

ELISA é mais sensível.
Western Blot é mais específico - permite confirmar diagnóstico.
Western Blot permite caraterizar algumas propriedades das proteínas, para além de fazer a sua quantificação.

30

Quais são as aplicações do Western Blot?

Ensaios confirmatórios:
º Reações de hipersensibilidade mediadas por IgE;
º Serologias infeciosas;
º Autoanticorpos.

31

Quais os tipos de ensaios de imunofluorescência?

2 tipos:
- Direta
- Indireta

32

Imunofluorescência Direta

(Não se usa na Imunologia) => Usado principalmente na Anatomia Patológica.
- Ac específico marcado com fluorocromo.
- É aplicado diretamente sobre o corte de tecido onde se quer identificar o Ag.
- Vê-se a amostra ao microscópio de fluorescência.

33

Imunofluorescência Indireta (IFI)

- Ac específico e um segundo Ac marcado com fluorocromo.
- Coloca-se o soro do doente sobre um substrato adequado, que depende do Ac a pesquisar e da dispobilidade de Ag nos tecidos.
- Adiciona-se antiglobulina humana (2º Ac), marcada com fluorescência.

34

Quais os fluorocromos mais utilizados?

FITC;
PE;
Rodamina B.

35

Quais as aplicações da IFI?

Deteção de autoanticorpos (screening de doenças autoimunes) - ANA, ANCA, ASMA, anti-TSH;
Deteção de Acs contra agentes infeciosos;

36

Como se avaliam os fatores do complemento através do imunoensaio?

Doseamento:
- Nefelometria / Turbidimetria (C3,C4);
- ELISA;
- IDR;
Estudos Funcionais:
- ELISA;
- IDR.

37

Porque se usam eritrócitos para estudar os fatores do complemento?

Estuda-se a atividade hemolítica, porque esta é vísivel a olho nu.

38

Como se estudam as serologias infecciosas?

Serologias virais e doenças congénitas:
- ELISA / EIA;
- Quimioluminescência;
- Imunfluorescência indireta (IFI);
Ensaios confirmatórios:
- Immunoblot;
- Biologia molecular.

39

Como se distingue uma infeção antiga de uma 1ª infeção?

Infeção recente / aguda => IgM aumentado
Infeção antiga / crónica => IgG aumentado

40

Se estiver perante IgM e IgG aumentados, o que está a acontecer?

a) Seroconversão;
b) Reinfeção (há aumento de IgM por causa das células de memória).

41

Se tiver IgM e IgG aumentados, como distingo uma 1ª infeção de uma reinfeção?

Através da avidez da ligação:
- Avidez maior = infeção antiga;
- Avidez mais baixa = primeira infeção.

42

Que ensaios uso para identificar a presença de autoanticorpos?

Screening:
- Imunofluorescência indireta (IFI);
Ensaios confirmatórios:
- Ensaios imunoenzimáticos;
- Immunoblot;
- Reações de precipitação;
- Ensaios Multiplex.

43

Qual o substrato usado nos IFI para avaliar anticorpos antinucleares (ANA)?

Células Hep2.

44

Na IFI, o que devemos também avaliar, para além do estado geral da célula?

Mitoses.

45

A partir de que título se considera o IFI como teste positivo?

1/160.

46

Quais os quatro padrões existentes no IFI?

- Difuso / Homogéneo;
- Mosqueado;
- Centrómero;
- Nucleolar.

47

Padrão Difuso ou Homogéneo

- Inespecífico;
- 2º padrão mais comum;
- Acs contra componentes dos cromossomas (dsDNA, histonas e nucleossomas);
- Mitoses positivas;
- Cromatina com coloração intensa, uniforme.

48

Quais as patologias associadas ao padrão difuso?

- Lúpus Eritematoso Sistémico (LES);
- Lúpus induzido por fármaco.

49

Padrão Mosqueado

- Inespecífico;
- Padrão mais comum;
- Acs contra ENAs (Ags nucleares extraíveis) [antiRNP, antiSm, antiSSA, antiSSB);
- Mitoses negativas;
- Cromatina sem coloração.

50

Quais as patologias associadas ao padrão mosqueado?

- LES (antiSm);
- Mixed connective tissue disease (MCTD) [antiRNP];
- Síndrome de Sjorgen (antiSSA, antiSSB).

51

Padrão Centrómero

- Específico para CREST;
- Acs dirigidos contra centrómeros;
- Mitoses positivas;
- Pequenos pontos fluorescentes no núcleo, agrupados ao longo do eixo mitótico.

52

Quais as patologias associadas ao padrão centrómero?

- CREST (calcinose, fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodermia, telangiectasias);
- Cirrose biliar primária.

53

Padrão Nucleolar

- Relativamente específico para ES Difusa;
- Acs dirigidos contra os nucléolos;
- Pode surgir associado a outros padrões;
- Mitoses: a cromatina pode aparecer negativa, positiva, ou com alguns pontilhados.
- OBRIGATÓRIO pesquisar Scl-70 (Ac antiDNAtopoisomerase I) e Ac antifibrilarina (esclerose sistémica).

54

Quais as patologias associadas ao padrão nucleolar?

- Esclerodermia;
- Doenças autoimunes reumáticas;
- Miosite.

55

Como se avaliam as Igs e as proteínas de fase aguda?

Doseamento:
- Nefelometria / turbidimetria;
- ELISA;
- IDR;
- Eletroforese das proteínas séricas;
Estudo da monoclonalidade das Igs:
- Imunofixação;
- Imunoeletroforese;
- Eletroforese das proteínas séricas.

56

Pré-albumina

Sintetizada no fígado;
Nem sempre aparece;
Transporta hormonas tiroideias e derivados da vitamina A.

57

Quais as diferentes bandas de proteínas séricas?

(da esquerda para a direita):
[Pré albumina];
Albumina;
Alfa 1;
Alfa 2;
Beta;
Gama.

58

Proteínas séricas

Macromoléculas, compostas por a.a. com ligações covalentes entre si.

59

De que depende a separação eletroforética?

pH do meio;
força iónica da solução tampão.

60

Níveis baixos de pré albumina sugerem...

Reações de fase aguda;
Má nutrição proteica;
Doença hepática.

61

Qual a proteína mais abundante do soro?

Albumina.

62

Onde é sintetizada a albumina?

No fígado.

63

Qual a função da albumina?

Transporta várias substâncias.
Mantém pressão oncótica.

64

O que sugere um aumento da albumina?

(Aumento é relativo, e raro)
- Desidratação.

65

O que sugere uma diminuição da albumina?

- Baixa produção hepática (má nutrição, doença hepática grave);
- Aumenta da perda ou degradação (síndrome nefrótico - perda renal, queimadura - perda pela pele);
- Inflamação crónica ou aguda;
- Gravidez (aumenta volume sanguíneo);
- Analbuminémia congénita.

66

Bisalbuminémia

Duplo pico de albumina;
Pode ser congénita ou induzida por drogas;
Associada a pancreatites agudas.

67

Qual a proteína que consitui cerca de 90% da região alfa 1?

Alfa 1 antitripsina.

68

Quais são as restantes proteínas da região alfa 1?

Thyroid binding globulin;
Alfafetoproteína (AFP);
Alfa 1 glicoproteína ácida;
Alfa 1 lipoproteína (HDL).

69

Onde são sintetizadas as proteínas da região alfa 1?

Fígado.

70

A região alfa 1 engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?

Positivas.

71

O que leva a um aumento da região alfa 1?

Inflamação aguda e crónica;
Neoplasia (ex: aumento de AFP = hepatocarcinoma);
Pós trauma ou cirurgia;
Gravidez;
Estrogenoterapia.

72

O que leva a uma redução da região alfa 1?

Deficiência em alfa 1 antitripsina (enfisema, cirrose hepática);
Doença hepática.

73

Quais as proteínas que fazem parte da região alfa 2?

Haptoglobina;
Ceruloplasmina;
Alfa 2 macroglobulina.

74

Onde são sintetizadas as proteínas da região alfa 2?

Fígado.

75

Qual(is) a(s) proteína(s) responsáveis pelo metabolismo do cobre?

Haptoglobina;
Ceruloplasmina.

76

Qual a proteína sérica de maior tamanho?

Alfa 2 macroglobulina.

77

A região alfa 2 engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?

Positivas.

78

O que leva a um aumento da região alfa 2?

- Proteínas de fase aguda ( ceruloplasmina e haptoglobina);
- Síndrome nefrótico (diminuição da albumina e aumento de alfa 2 macroglobulina).

79

O que leva a diminuição da região alfa 2?

Diminuição da ceruloplasmina:
- Doença de Wilson
- Má nutrição
- Síndrome nefrótico
- Enteropatia com perda de proteína
Diminuição haptoglobina:
- Hepatopatias graves
- Anemia megaloblástica
- Hemólise intravascular
- Anemia hemolítica

80

O que são os anéis de Kayser-Fleischer?

Aparecem na doença de Wilson, à volta da íris, devido à deposição de cobre.

81

Quais as proteínas da região beta?

Beta1:
- transferrina;
- beta lipoproteínas;
- outros fatores do complemento;
Beta 2:
- C3;
IgA, IgM, IgG: também podem aparecer nesta região

82

A região beta engloba proteínas de fase aguda positivas ou negativas?

Negativas.

83

O que leva a um aumento da região beta?

º Aumento da transferrina: anemia ferropénica, gravidez e estrogenoterapia;
º Aumento das betalipoproteínas: hipercolesterolémia de tipo II, hipotiroidismo, cirrose biliar, síndrome nefrótico, alguns casos de DM;
º Aumento de C3: inflamação, hipertensão maligna, doença de Cushing, carcinomas.

84

O que leva a diminuição da região beta?

º Diminuição da transferrina: inflamação aguda (diminui síntese hepática);
º Diminuição C3: deficiências genéticas.

85

Quais as proteínas da região gama?

Igs: IgA, IgG, IgD, IgM e IgE.
Maioritariamente constituída por IgG.
PCR migra entre região beta e gama.

86

O que traduz um aumento da região gama?

Síndromes linfoproliferativos;
Hiperimunização;
Infeções agudas;
Doença hepática crónica;
Doença inflamatória crónica;
Neoplasias disseminadas.

87

O que traduz uma diminuição da região gama?

Idade;
Deficiência congénita ou adquirida;
Tratamento imunosupressor (HIV, transplantação).

88

Quais os perfis existentes em eletroforese de proteínas séricas?

- Perfil normal;
- Hipogamaglobulinémia /agamaglobulinémia;
- Pico policlonal (com diminuição Alb = não muito grave);
- Pico monoclonal (diminuição relativa Alb = neoplasia);
- Reação de fase aguda (aumento alfa 1 e 2, diminuição Alb como compensação rápida);
- Inflamação crónica (aumento gama, parece pico policlonal, mas Alb mantém-se =).

89

Imunoeletroforese

Praticamente substituída por imunofixação.
Feita no soro ou na urina.

90

Na imunofixação há controlo?

Não. Prescinde-se do controlo.

91

Quais as amostras possíveis para imunofixação?

Soro, urina, LCR.

92

Como se faz imunofixação?

1. Separação eletroforética da amostra;
2. Aplicação de tira de acetato de celulose com antisoro embebido;
3. Antisoro difunde-se no gel;
4. Complexos Ac-Ag precipitam;
5. Coloração dos complexos.

93

Que tipos de gamapatia existem?

Hipogamaglobulinémias:
º Agamaglobulinémia (diminuição acentuada de todas as Igs);
º Hipogamaglobulinémia (diminuição de todas as Igs);
º Disgamaglobulinémia (deficiência seletiva).
Hipergamaglobulinémias:
º Monoclonal (elevação em pico, monoclonalidade da linhagem B, maligno);
º Policlonal (elevação em barriga, estados cirróticos);
º Oligoclonal.

94

Quais os testes laboratoriais ideias para identificações de hipogamaglobulinémia?

Doseamento das Igs;
Eletroforese das proteínas;
Imunofixação.

95

Nas hipergamaglobulinémias, é importante distinguir um pico monoclonal de um pico policlonal?

SIM.
Os picos monoclonais estão associados a processos clonais malignos (neoplasias).

96

Exemplos de gamapatias monoclonais

Mieloma múltiplo;
Mieloma múltiplo assintomático;
Plasmocitoma solitário;
MGUS (pico monoclonal de origem indeterminada);
Macroglobulinémia de Waldenstrom;
Amiloidose;
Doença de cadeias pesadas;
Doenças linfoproliferativas B (linfomas, LLC).

97

Quais os testes laboratoriais usados para detetar gamapatias monoclonais?

Eletroforese de proteínas séricas;
Imunofixação / Imunoeletroforese;
Doseamento de Igs;
Doseamento de cadeias leves integrais;
Doseamento de cadeias leves livres séricas.

98

Doseamento de cadeias leves integrais

Determinado pela concentração de Igs intactas, normalmente IgA, IgG e IgM.

99

Aumento das cadeias leves integrais

Proliferação poli ou monoclonal.
Gamapatia monoclonal implica alteração da razão kappa:lambda.

100

Diminuição das cadeias leves integrais

Declínio de Igs intactas.

101

Doseamento de cadeias leves livres (CLLs)

CLLs são filtradas no glomérulo e reabsorvidas nos túbulos renais;
CLLs kappa: monómeros, eliminadas 2-4 horas;
CLLs lambda: dímeros, 3-6 horas.

102

Proteinúria de Bence Jones

Quando o aumento de CLLs excede a capacidade de reabsorção tubular, ou seja, há excreção de CLLs pela urina.

103

O soro contém mais CLL kappa ou lambda?

Mais CLL lambda, porque a filtração kappa é três vezes mais rápida que a filtração lambda.

104

Quantos sistemas tem a citometria de fluxo?

Três:
- Sistema de fluidos;
- Sistema óptico;
- Sistema eletrónico.

105

Quais os parâmetros avaliados pela citometria de fluxo?

> Side scatter - 90º, complexidade e granularidade;
> Forward scatter - 180º, tamanho e superfície.

106

Quais os marcadores específicos das subpopulações linfocitárias?

Linf. T: CD3+
- T Helper: CD3+ CD4+;
- T citotóxica: CD3+ CD8+;
Linf. B: CD19+
Cél. NK: CD56+, CD16+, CD3-

107

A citometria de fluxo traduz-se graficamente em...

Dot plots.

108

Para que serve o valor absoluto da citometria de fluxo?

Prognóstico;
Terapêutica.

109

Quais as aplicações clínicas da citometria de fluxo das subpopulações linfocitárias?

- Estudo e caracterização de imunodeficiências;
- VIH / SIDA;
- Estudo e caracterização de doenças autoimunes;
- Despiste de leucemias / linfomas.

110

Como é a razão CD4/CD8 normal?

O normal é ter mais CD4.
Uma inversão desta razão é sinal de patologia.

111

O que é avaliado num ensaio funcional?

Funções da resposta inata:
- Fagocitose;
- Metabolismo oxidativo;
- Ativação de TLR;
- Citotoxicidade NK;
- Desgranulação de basófilos.
Funções da resposta adaptativa:
- Proliferação em resposta a estímulos;
- Produção de citocinas;
- Citotoxicidade T.

112

Como se faz um ensaio funcional da fagocitose?

Com E.coli opsonizada com Ig e complemento e marcadas com FITC.

113

Qual é o estímulo necessário para a ativação do burst oxidativo dos neutrófilos?

PMA.

114

Como se faz um ensaio funcional do metabolismo oxidativo?

1.- Dá-se PMA para estimular neutrófilos.
2.- Marca-se substrato DHR123 com corante encarnado.
3.- Se houver oxidação, DHR123 passa a R123 e fica verde.

115

Doença granulomatosa crónica

- 70% dos casos de défice no metabolismo oxidativo.
- Défice de NADPH oxidase.
- Ligada ao X.
- Mais raro: autossómica recessiva.

116

Portadora sintomática

Menos sintomas, porque X normal compensa.

117

O que leva a diminuição da fagocitose?

Defeitos no neutrófilo;
Alterações do complemento;
Diminuição das Igs;
Trauma;
DM;
Falha renal;
SIDA.

118

O que leva a aumento da fagocitose?

Ação imunomoduladora:
º IL-2;
º Interferão gama;
º Ácido lático.

119

O que leva a diminuição do metabolismo oxidativo?

- Doença granulomatosa crónica (NADPH oxidase);
- Transplantação;
- SIDA;
- Idade.

120

Como se avalia a função linfocitária?

Isolamento de PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) por gradiente de densidade;
Avaliação da proliferação celular (num citómetro de fluxo, com marcadores de proliferação).

121

O que são ensaios Multiplex?

Permitem avaliação e doseamento de citocinas e outras moléculas.
Semelhante a 10 placas de ELISA num só teste, mas utiliza esferas para identificar moléculas.

122

Quais as amostras dos Multiplex?

Soro / plasma;
Outros líquidos biológicos;
Sobrenadantes de culturas celulares.

123

O que é a alossensibilização?

Existência de Acs contra Ags da própria espécie.

124

Quando pode ser feito o estudo da alossensibilização?

- PRA (panel reactive antibodies) pré transplantação;
- Crossmatch na altura da transplantação;
- PRA após transplantação ou estudo específico em crossmatch com células do dador previamente congeladas.

125

O que significa existirem anticorpos anti-HLA?

Rejeição de um transplante.

126

Entre 2 doentes, um mais alossensibilizado que outro, qual vamos escolher transplantar?

O mais alossensibilizado, porque tem menor probabilidade de voltar a encontrar compatibilidade.

127

Como se faz o estudo crossmatch dador - recetor?

- CDC;
- Citometria de fluxo.