Lezione 55:trascrittomica A Singola Cellula Flashcards
(16 cards)
Cos’è la trascrittomica a singola cellula?
È una tecnica per studiare quali geni sono attivi in una cellula di un tessuto.
Ci dice quali mRNA sono presenti in ogni cellula
Perchè la trascrittomica a singola cellula è diversa da quella tradizionale (o bulk)?
-trascrittomica tradizionale (bulk)—-> analizza tutto l’RNA contenuto in tutte le cellule di un tessuto (si perde l’informazione su quale cellula esprime cosa)
-trascrizttomica a singola cellula—-> si guarda una cellula per volta
Quali sono le fasi della trascrittomica a singola cellula?
- Prendo un tessuto fresco
- Si separano le cellule del tessuto
- Si usa la RNA-seq per misurare gli mRNA di ogni singola cellula
- Si ottiene un profilo di quali geni sono attivi in ciascuna cellula
Come si possono interpretare i dati della trascrittomica a singola cellula?
PCA (analisi delle componenti principali)—-> si fanno dei grafici in cui ogni punto è una cellula.
In particolare:
*cellule con profili simili—-> sono vicine tra loro
Dimmi 6 modi per ottenere una popolazione di cellula da poter sequenziale tramite RNA-seq
1) uso pipetta—-> prelevo cellule tramite pipetta, le inserisco in un bozzetto e attivo la produzione di cDNA (molto lento!)
2)analisi al microscopio—_>seleziono le cellula che al microscopio sono simili tra loro (classificazione solo morfologica che non garantisce omogeneità molecolare)
3)Flow Cytometry—->se paro le cellule tra loro, le faccio passare in un FACS che le separa sulla base di marcatori specifici (altera temporaneamente l’espressione genica delle cellule)
4)microscopio laser—->ritaglio porzioni precise del tessuto e isolo le cellule (utile solo quando le cellule hanno caratteristiche istologiche chiare)
5)microfluidica a goccioline—-> più usata
6)bead magnetiche—->uso bead magnetiche legate ad anticorpi per selezionare le cellule che hanno uno specifico marcatore n superficie
In cosa consiste la tecnica “microfluidica a goccioline”?
1)isolo le cellule dal tessuto tramite enzimi
2)microfluidica—-> inserisco la cellula in un sistema microfluidico
3) formazione goccioline di olio(droplets)—-> contengono
*beads di oligonucleotidi con primer dT
*cellula da analizzare
(Le beads contengono oligonucleotidi con primers dT per legarsi alla coda poli A dell’mRNA, codice a barre univoco per identificare quella cellula, un secondo codice a barre per identificare la singola molecola di RNA)
4)retrotrascrizione—-> produco cDNA
5)amplifico il cDNA tramite PCR
6)sequenziamento tramite Next Generation Sequencing
Qual è
-limite
-vantaggio
Della trascrittomica a singola cellula
-limite—-> si analizzano 1000-4000 trascritti (invece la trascrittomica tradizionale ne analizza 12.000-15.000)
-vantaggio—-> permette di analizzare tante cellule contemporaneamente
Cos’è la single nucleous RNA-seq?
È il sequenziamento degli mRNA presenti nel nucleo di una cellula (quindi dei trascritti primari e non degli mRNA maturi del citoplasma!)
Si usa es. con i sincizi (in cui i nuclei sono tutti diversi tra loro)
Per prelevare le cellule uso la microfluidica a goccioline (ogni gocciolina conterrà un beads e un nucleo)
Quali sono i geni marker di
-monociti
-cellule dendridiche
-cellule B?
-monociti—->CD14
-cellule dendridiche—->CD11C
-cellule B—->CD19
Dimmi 5 motivi per cui viene usata la trascrittomica a singola cellula
-identificazioni dei tipi cellulari presenti nel corpo umano
-studio dell’eterogenicità tumorale (quindi del microambiente tumorale)
-analisi del sangue e biopsie liquide
-studio della differenziazione cellulare
-identificazione di cellule anomale
Cosa sono le biopsie liquide?
Sì analizza il sangue per studiare le cellule tumorali senza dover asportarlo chirurgicamente
Cos’è il progetto TABULA SAPIENS?
È un Atalanta dei tipi cellulari umani.
Sono stati identificati 400 tipi cellulari (senza contare i neuroni)
Cos’è lo zebrafish?
È un pesciolino (vertebrato) usato negli studi di biologia sullo sviluppo.
Infatti esso è trasparente i primi giorni di sviluppo e quindi è possibilie osservare tutto l’embrione al microscopio
Cos’è la trascrittomica spaziale?
Un tipo di sequenziamento che mantiene i rapporti spaziali tra le cellule (infatti alcune cellule esprimono ceri segnali solo se sono a contatto l’una con l’altra)
Quali sono i 2 approcci della trascrittomica spaziale?
-imaging—> si basa sull’ibridazione fluorescente in situ dell’RNA
-sequencing—-> si trasferiscono gli RNA dal tessuto a l sequenziatore mantenendo la sua posizione originaria quando viene eseguita l a sequenza
