F7 DNA metoder Flashcards Preview

Genetik > F7 DNA metoder > Flashcards

Flashcards in F7 DNA metoder Deck (36)
1

Single nucleotide polymorphism (SNP)

DNA markør:

Variationer af placering af et nukleotidposition på et kromosom

ATTCCG (befolkning)
AATCCG (få individer)

Minder meget om punktmutation:
- Baseudskiftning i DNA
fx med ATTCCG --> AATCCG

Funktion:
- Silence mutations
- Ændrer ikke et proteins funktion og udseende

2

Mikrosatellit ustabilitet
Microsatellite instability (MSI)

Hvor generne hypermuterer, hvilket resulterer i beskadiget DNA repair cellerne

3

Repetitivt DNA

DNA sekvenser der gentages flere gange igennem genomet

4

VNTR

(Variable Number of Tandem Repeats)

Variabelt antal repeats efter hinanden

- Mikrosatellit (2-5bp)

Komplementær base-parring kan identificere antallet af specifikke enheder i gDNA (genomisk DNA)

Analysen udføres på isoleret gDNA

Man benytter enten SB eller PCR

- Southern blot med probe, der er komplementær med Tandem Repeat-sekvenserne

eller

- PCR med primere der er modsatte af Tandem Repeat-sekvensen

5

Restriktion fragment længde polymorfi (RFLP)

Minisatellitter (20-70bp)

Gerningsmand finger:

Bestemte restriktionsenzymer klipper/kløver DNA op i kortere del.
De analysere derefter i gel og man kan se forskel på forbryderen eller syg og rask gen.

Det er derfor RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfi) man benytter i en Gel-elektroforese

6

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA metode:

Efterlignet replikation af DNA: 4 steps:
PBPE Pikken Boller Peter Eww

P 1. Primer tilsættes

2. Byggesten for DNA tilsættes: dNTP

3. DNA polymerase tilsættes og der laves 40 kopier/cyklusser ved tre steps:
- Denaturering 95' (DNA adskilles)
- Annealing 55' (Primer på template DNA)
- Elongering 75' (Syntisering af DNA)

4. Elektroforese adskiller DNA



PCR uddybet version:

Trin i PCR: PR3G - Prøv Røvhullet 3 Gange!
- Primere
- Reaktionsbuffer
- 3step
- Gentage cyklusser

A. To primere syntiseres så de er komplimentere med hver deres DNA-streng

B. Reaktionsbuffer
- Mixing af primere i reaktionsbuffer med:
- DNA
- DNA polymerase
- dNTP

C.:
- Denaturering
- Annealing
- Elongering

CI. Denaturering (96')
- DNA bliver enkeltstrenget

CII. Annealing (58')
- Primere bindes til DNA strengen

CIII. Elongering (74')
- DNA polymerase virker optimalt
- Afgør hvor mange nukleotider primerne bliver forlænget med

D. Gentagne cyklusser
- DNA stykket bliver massivt kopieret

7

Southern blot (SB)

DNA metode:

Søger efter variationer i specifikke dele af DNA og bygger på komplementær baseparring.
Kigger efter repeteret (repetitivt) DNA.

Southern Blot = Skide Bagdel:

KEB HEB
Klør Esbergesere Bollerne Hahaha Eller Bagdelen

1. Kløvning (deler)
Restriktionsenzymer (RE) kløver/deler) DNA deles op i enkelte separate DNA strenge i agarose gel

2. Elektroforese
- Adskiller fragmenterne ved denaturering

3. Blotting
- Overførsel fra gel til nylon-membran

4. Hybridisering
- Tilføjer radioaktiv DNA probe

En probe (enkeltstrenget DNA som er komplementær med sekvensen man vil finde)

5. Eksponering
Røntgenfilm
- Signal fra proben identificeres ved røntgenfilm (giver båndmønster)

6. Båndmønster
- Autoradiografi


Bruges til at bestemme RFLP til at amplificere et resultat.
Et i-mange-stykker klippet DNA vil bare give et diffust elektroforese resultat, DNA overføres fra gel til en membran og en probe (udvalgt stykke af DNA).
De udvalgte prober kan (radioaktivt mærket) tilføres et DNA produkt og ved deres kobling til komplimentær DNA, amplificerer deres mærkning resultat

8

Gel elektroforese

Forskel mellem positiv og negativ spænding.

De korte vandrer nederst og længst mod plus-enden.
De lange forbliver øverst mod minus-enden.

DNA molekyler er altid negativt ladet --> Derfor vandrer de mod den positive ladede ende.

1. Påsætning af prøve
- Agarose gel

2. Elektroforese

3. Visualisering under UV-lys
- Langt bånd, kort bånd

9

Restriktionsenzymer

Klipper/kløver specifikke DNA sekvenser ud af DNA'et

10

Restriktionskort

Overordnet kort over restriktionssite over DNA

11

DNA sekventering (dideoxy sekventering)

DNA metode:

Identificere rækkefølgen af baser i et bestemt DNA-sekvens med FARVER (fx. et gen)

De enkelte basesekvenser (A,T,G,C) kan gengives i 4 forskellige faser.

- Metoden benytter centrale elementer fra PCR

AED - Hjertestarter!

1. Annealing
- Primer bindes til DNA template

2. Elongering
- DNA-polymerase forlænger primer, da DNA polymerase virker optimalt ved 74'C

3. Denaturering
- Cyklus fortsætter herefter

Der kræves:
- DNA template (enkeltstrenget DNA)
- DNA polymerase
- dNTP og ddNTP
- Primer
- Buffer

12

Microarray (genom/epigenomanalyser)

DNA metode:

Kan bruges til at analysere hele genomet.

Er en lille glasplade med 1000 huller i, som indeholder syntetiseret DNA sekvenser.

Hvert hul reagerer på et specifikt DNA sekvens som man ved er SYGT DNA.

De huller der er komplimentære til cDNA reagerer = Sygt DNA.

13

RT-PCR

Metode at gå fra mRNA til cDNA.

Metode til at undersøge RNA og om RNA udtrykker det korrekte sekvens.

Reverse Transkription PCR

14

cDNA syntese

Man danner cDNA ud fra Reverse Transkriptase (fx RT-PCR), hvor vi kun har EXONS.


((Måske rigtigt?
:
Går videre til enten PCR eller qPCR

PCR: Splejsning (intron tilbageholdes)

qPCR: Ekspression (exon skippes over)
q: quantitativ))

15

Plasmid

En bakteries enkeltstrenget/dobbeltstrenget, DNA molekyle.

Kan kopiere sig selv (ligesom menneskets DNA)

16

Primer

10 bp langt Protein der starter DNA syntese.

Anvendes næsten kun i PCR metode.

17

Oligonukleotid

En DNA sekvens.

En kort kæde af nukleotider på 5-50bp langt.

Et kort stykke RNA/DNA, kan bl.a. bruges til PCR

18

Denaturering

Man hæver temperaturen til 96', så man kan adskille dobbeltstrenget DNA.

19

1. Hybridisering
2. Annealing

I hvilke metoder bruges de hver især?

1. Bruges i Southern Blot

1. Proben, som er mærket med radioaktiv eller fluorescerende signal tilsættes en nylon-membran


2. Bruges i PCR

2. En primer tilhæfter sig enkeltstrenget DNA, hvorefter en DNA polymerase sætter sig på og vi kan få syntetiseret DNA.

20

DNA profil

Et lille sæt af DNA variationer, som altid bliver forskellig fra menneske til menneske

Kaldes også forensic DNA profile, da det bruges af retsmedicinere.

Små VNTR og mikrosatellitter

21

Revers transkriptase

Enzym man bruger til at danne cDNA

22

FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)

Kan analysere 300.000 bp og opaf.

FISH og SKY bruger man til at analysere metafasekromosomerne

Anvendelsemuligheder af FISH:
- Translokation
- Deletion
- Duplikation
- Lokation af unik DNA-sekvens (gen-lokalisering)
- Kønsbestemmelse
- Aneuploidi undersøgelse

BDCF-ODH
Boller Drengen Carlos Fisser Om Dagen hårdt?

1. Blodprøve

2. Dyrkning af celler

3. Tilsæt Colchicin
- Ødelægger téntrådsapparatet --> celledelingerne stoppes
- Metafasekromosomer kan analyseres

4. Fiksér celler
- Fastfrysning af cellerne

5. Spred celler på præparatglas vha. ''dråbeteknik''

6. Denaturering
- DNA strengene i metafase-kromosomerne

7. Hybridrisering med fluorescerende denatureret probe
- Der vil komme 4 signaler fordel at de to homologe kromosomer har 2 hver = Ét på hvert søsterkromatid

23

Restriktionsenzymer

Nogle bakterier har specielle enzymer, som kan dele den dobbeltstrengede DNA

Restriktionsenzymerne kan genkende bestemte palindrome sekvenser (4-8 bp) og dele dem, så man har 2 af hver.

Palindrome (CAT TAC), man kan skrive ordet bagfra.
Madam I'm Adam
Otto, Anna, Radar

24

Probe

En lille del af et DNA stykke (udsnit)

En Probe er komplementær til den DNA streng, man ønsker at identificere / detektere.

25

Restriktionskort

En oversigt over stederne restriktionsenzymerne klipper
- For at kunne orientere sig i meget lange DNA-sekvenser
- DNA'et kløves med RestriktionsEnzymer

26

Elektroforese

Agarose-gel med ehtidium bromid, med tilslutning strøm lader DNA vandre ned genenm gel og fordeler sig ifht. længden af DNA produktet.
Har man en mutation i fx en DNA streng, vil EcoR1 ikke kunne skære det over og elektroforese vil afsløre at DNA er blevet ''for langt''

27

Vektor

Medie for transport af DNA
En virus tømt for naturligt forekommende DNA er hyppigt valg ifht. Genterapi

28

DNA markør

Et sted på et gen hvor der findes en sekvens som man kender, som man kan udpege og genkende igen

29

Mikrosatellitmarkører

DNA markør:

Benyttes ved at se forskel på menneskers IKKE-kodende DNA!

3 forskellige VNTR (Variable Numer of Tandem Repeats):
- Satellit DNA
- Minisatellit DNA (20-25bp)
- Mikrosatellit DNA (2-5bp)

Gentagelser af DNA sekvenser

Bruges i PCR

30

At amplificere

At danne nyt

31

SKY

Spektral Karyotypebestemmelse

SKY og FISH bruges til at analysere metafasekromosomer

24 farvede karyotyperinger

Man kan se:
- Reciprok translokationer
- Translokationer
- Robertsonian translokationer
- Duplikationer

32

Båndfarvning

Farvning af kromosomer, hvor det ligner at kromosomerne får et svedbånd rundt om armen/benet.

Det er en teknik, der giver anledning til fremkomst af kromosomspecifikke båndmønster.

Tjekker for store additioner, deletioner, translokationer etc. på KROMOSOMAL niveau.

33

Krydskonfiguration

Arrangement af ubalance kromosomer pga. recibrok translokation

En parringsfigur af kromosomer. Når deling sker - er alle kombinationer mulige.

En skitsetegning hvor alt der er homolog passer sammen.

34

In Situ Hybridisering

Kortlægge geners abnormaliteter

Molekylær genkortlægningsteknik hvor mærkede prober er hybridiseret til farvede metafasekromosomer.

Derefter udsat for røntgenfilm for at vise probens placering.

35

CGH

Comparativ Genom Hybridisering - Man sammenligner SYG med RASK

Bruges til: ADDT
- Addition
- Deletion
- Duplikation
- Translokation
Men IKKE balancerede afvigelser som fx RECIPROK TRANSLOKATION
(CGH array bruges til mindre ting)

Fordele:
- Sammenligning af DNA
- Ikke behov for replikation
- Man behøver ikke at vide hvad man leder efter

Ulemper:
- Viser alt over 5-10Mbp
- Dårlig opløsning (over 5 mio. bp)
- Viser ikke balancerede afvigelser på kromosom niveau

36

Hvis en mutation er til stede hvad ville man bruge af DNA markører hvis udgangsmaterialet er:

1. cDNA
2. gDNA

1.
PCR og gel elektroforese
På denne måde får vi amplificeret/kopieret genet nok gange til at se DNA sekvenserne, når de kører gennem en gel.

Ved at sammenligne med en rask kontrolperson vil vi kunne se at mutationen er til stede.
Man ser forskellen ved at DNA stykkerne fra test-personen er kortere og kommer højere/længere op i gelen

2. Vi kan lave en RFLP
Restriktionsenzymerne vil ikke klippe der hvor mutationen er --> en for lang DNA sekvens.
Gel + sammenligne med rask kontrol person