Mutaciones que afectan a regiones no codificantes

Question 1

Secuencias de consenso que determinan el principio y el final del intrón

Answer 1

● Principio: GT . 5’ splicing site
● Final: AG . 3’ splicing site

Question 2

Formación del spliceosoma

Answer 2

Una serie de ribonucleoproteínas reconocen estas secuencias y se unen formando un complejo, el spliceosoma.

Question 3

Función spliceosoma

Answer 3

Elimina los intrones y une los dos exones. El intrón se va, el complejo se deshace, se degrada el intrón y se forma el mRNA maduro.

Question 4

Downstream del sitio de splicing 5’ hay

Answer 4

Un tracto de poli-pirimidinas (Y, pirimidina = poli-Y)

Question 5

Upstream a la poliY, encontramos

Answer 5

Una Adenina, punto de ramificación

Question 6

Mecanismo de splicing

Answer 6

En un intrón el AG y GT tienen que quedar espacialmente cerca —> spliceosoma se une al branch point (A) y acerca los extremos para que entren en contacto = lazo.

Exón 1 (extremo 5’) queda cerca del siguiente exón. Ataca al enlace fosfodiéster del extremo 3’, lo rompe, y se unen.

Liberación del intrón en forma de circular RNA, unido a lo que era el spliceosoma —> RNA intrónico participa en procesos posteriores y luego se degrada.

Question 7

Importancia del splicing

Answer 7

Permite que un gen genere distintos mRNA, distintas proteínas, con una misma capacidad codificante

Question 8

Cada gen genera

Answer 8

4 transcritos alternativos distintos, de promedio, con distintos exones.

Question 9

Patrón de splicing

Answer 9

Cambia de un tejido a otro (= gen puede tener distinta expresión)
- exón cassette: puede cambiar todo el marco de lectura a partir de este
- exones que son mutuamente excluyentes: si uno está presente, el otro no permanecerá en el mRNA y viceversa.

Question 10

Factores que regulan el splicing

Answer 10

Ribonucleoproteínas
Enhancers y silencers

Question 11

Ribonucleoproteínas

Answer 11

snRNP U1, snRNP U2, U2AF

Se unen a cada una de las secuencias de consenso = spliceosoma.

(Se van plegando siempre igual, dejando una serie de dominios, que son catalíticos, a la vista —> reconocen regiones por complementariedad de bases y se unen)

Question 12

U1 se unirá a

Answer 12

Región de splicing 5’, de bases GU (GT en el DNA).

Question 13

U2 siempre se unirá a

Answer 13

Región branch point donde se encuentra la Adenina (A)

Question 14

U2AF se unirá a

Answer 14

Dominio de 65 kD U2AF se unirá a las poli-pirimidinas (poli-Y)

Dominio de 35 kD U2AF se unirá a la región splicing 3’ (AG)

Question 15

¿Cómo es posible que la célula sólo reconozca como sitios de splicing esos GT y AG, si hay un montón por todo el genoma?

Answer 15

i. Contexto de secuencia que les hace + fuertes y + propensos al splicing.

ii. Estas señales básicas están reforzadas por otros tipos de señales: enhancers o silencers del splicing

Question 16

Intronic splicing enhancer

Answer 16

Secuencias de nucleótidos que actúan como potenciadores del splicing.
Hace que las señales sean fuertes.

Question 17

Intronic splicing silencer

Answer 17

Secuencias de nucleótidos que actúan como silenciadores del splicing. A ellos se unen proteínas que impiden que se estabilice el spliceosoma.

Question 18

Exonic splicing enhancers and silencers

Answer 18

Secuencias de nucleótidos que actúan como sitios de unión para proteínas. Algunas de estas potencian el spliceosoma y otras lo inhiben.

Question 19

Proteínas que se unen a los exonic splicing enhancers and silencers

Answer 19

HnRNPs: proteínas que se unen a los silenciadores (compite por el sitio de unión de U2AF)

SR (serina - arginina): se une a los enhancers de splicing y favorece la unión de las secuencias consenso de splicing al spliceosome.

Question 20

Efectos mutación sinónima

Answer 20

No cambia la proteína pero puede afectar al splicing por no encajar con el sitio de unión del enhancer / silenciador.

Las mutaciones sinónimas no siempre son neutras.

Question 21

Posibles mutaciones que alteran el mecanismo de splicing

Answer 21

Mutación que afecta al sitio de splicing 3’ (AG)
Mutación que afecta al sitio de splicing 5’ (GT)
Exonización de elementos Alu
Presencia de secuencias crípticas intrónicas
Presencia de secuencias crípticas exónicas
Mutaciones en los nucleótidos que rodean las secuencias consenso de splicing

Question 22

Mutación que afecta al sitio de splicing 3’ (AG)

Answer 22

• Exonización intrón 1: gran exón 1, splicing no ocurrirá y pasa al del siguiente = proteína más larga —> muy probable frameshift (proteína larga y truncada)
• Intronización exón 2 (“exon skipping”) : más probable, intrón 1 al no tener secuencia de terminación busca la del intrón 2 (exón 2 se introniza) = proteína más corta —> muy probable frameshift (proteína corta y truncada)

Question 23

Mutación que afecta al sitio de splicing 5’ (GT)

Answer 23

1. Exonización del intrón 1
2. Exon skipping.

Question 24

No siempre cada exón termina justo al final del codón

Answer 24

Puede pasar que, al eliminarse un exón, no cambie el marco de lectura pero quitarse o añadirse nucleótidos, se completa el codón del exón anterior con un nuevo nucleótido = esto puede dar lugar a codones de stop prematuros, mis-sense mutations,…

Question 25

Exonización de elementos Alu

Answer 25

Alu elements = repeticiones en el DNA. Los intrones están plagados de estos.

Alu tienen regiones que pueden funcionar muy bien como secuencia de consenso. Son regiones a las que se podría unir el U2AF, pero tiene más afinidad por ellas el HnRNP C, inhibidor de splicing. Mutación = se pierde esta silenciación —> parte del Alu se exoniza, y se añade así una secuencia mala, no codificante

Question 26

Presencia de secuencias crípticas intrónicas

Answer 26

Situación: muta AG (3’) y si ese intrón 1 contiene una secuencia de splicing críptico = nuevo sitio de splicing decente.

Es + débil que la secuencia original pero sirve —> exón 2 = + largo. Se añaden + Aa = proteína + larga con mucha probabilidad de que se de frameshift.

(Parte del intrón 1 se exoniza al exón 2)

Question 27

Presencia de secuencias crípticas exónicas

Answer 27

Situación: muta la terminación AG con + afinidad por el spliceosoma. No está el original —>se utiliza este nuevo sitio críptico (afinidad + débil pero decente).

Al encontrarse en el exón el nuevo sitio de splicing 3’ —> intrón + largo y exón 2 = + corto. Se pierden Aa = prot + corta y además, si no se pierden 3 o nº de Aa múltiplo de 3, cambiará el frameshift.

(Consiste en una intronización del exón 2)

Question 28

Nomenclatura mutaciones upstream al exón

Answer 28

Se designa con un signo “+” para decir que está a la derecha del exón en cuestión.

Question 29

Nomenclatura mutaciones downstream al exón

Answer 29

Se designa con un signo “-” para hacer referencia a los nucleótidos de la izquierda del exón, en el intrón del extremo 3’ (previos a la siguiente secuencia exónica de coding DNA)